[发明专利]用于改进的核酸扩增的聚阴离子

说明书

技术领域

本发明涉及模板依赖性聚合酶催化的引物延伸反应(如聚合酶链反应 (PCR))领域，。更确切地说，本发明提供进行热启动PCR的新方法， 其特征在于，通过在扩增反应之前加入规定的聚阴离子来避免非特异性引物 二聚体扩增。

背景技术

核酸扩增(尤其是PCR)的一个主要问题在于非特异性扩增产物的生 成。在很多情况下，这归因于实际的热循环程序本身之前的非特异性寡核苷 酸引导(priming)和随后的引物延伸事件(event)，因为热稳定DNA聚 合酶在环境温度下也有适度的活性。例如，经常观察到由于最后偶然发生的 引物二聚和随后的延伸而产生的扩增产物。为了克服这个问题，本领域众所 周知进行所谓的“热启动”PCR，其中将对于扩增反应必需的一种成分或者 从反应混合物中分离，或者保持失活状态直至反应混合物的温度第一次升 高。因为聚合酶不能在这些条件下起作用，所以在引物能非特异性结合的期 间不发生引物延伸。为了达到这个效果，应用以下几种方法：

a)DNA聚合酶的物理分离

物理分离例如可通过固体蜡形成的屏障来实现，固体蜡形成的屏障把含 有DNA聚合酶的部分和含有大多数其它试剂的部分分隔。首次加热步骤中， 蜡自动熔融，各流体部分混合(Chou，Q.等人，Nucleic Acids Res 20(1992) 1717-23，US 5,411,876)。或者，在扩增反应前使DNA聚合酶亲合固定在固 体载体上，并仅通过热介导释放将其释放到反应混合物中(Nilsson，J.等人， Biotechniques 22(1997)744-51)。然而，两种方法都是费时的，且不便操 作。

b)DNA聚合酶的化学修饰

对于这种热启动PCR，通过化学修饰使DNA聚合酶可逆地失活。更确 切地，将热不稳定保护基团引入到Taq DNA聚合酶中，这使酶在室温下失 活(US 5,773,258)。在PCR预处理步骤中于高温下除去这些保护基团，以 使酶变成有活性的。例如可通过使柠康酐或乌头酐(Aconitric Anhydride) 与酶的赖氨酸残基偶合来获得这种热不稳定修饰(US 5,677,152)。带有此 类修饰的酶同时是市售的，如Amplitaq Gold(Motetti，T.等人， Biotechniques 25(1998)716-22)或FastStart DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)。然而，保护基团的引入是一种化学反应，它可任意发生在 酶的所有空间可用(sterically available)的赖氨酸残基。所以，化学修饰酶 制备的可再现性和质量可变化，几乎不能控制。

c)DNA聚合酶的重组修饰

已通过基因工程制备Taq聚合酶的冷敏感突变体。这些突变体与野生 型酶的差别在于它们缺少N端(US 6,241,557)。与天然或野生型重组Taq 聚合酶相反，这些突变体在低于35℃时完全没有活性，所以在一些情况下 可用于进行热启动PCR。然而，N端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓 冲剂条件，与野生型酶相比具有较低的持续合成能力，所以只能用于短的目 标核酸的扩增。另外，由于截短形式缺乏5’-3’核酸外切酶活性，它不能用 于基于TaqMan检测设计(TaqMan detection format)的实时PCR(real time PCR)实验。

d)通过核酸添加剂抑制DNA聚合酶

已证实通过添加短双链DNA片段来抑制非特异性退火引物(annealed primers)的延伸(Kainz，P.等人，Biotechniques 28(2000)278-82)。在这 种情况下，引物延伸在低于短双链DNA片段的熔点温度下受抑制，但是与 竞争剂(competitor)DNA本身的序列无关。然而，尚不知，竞争剂DNA 过剩至何种程度会影响核酸扩增反应的产率。