[发明专利]人源化中和性抗流感NS1基因工程抗体制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种人源化单克隆抗体的制备方法与用途，具体涉及一种人源化抗流感病毒NS1蛋白中和性抗体的制备方法与用途。

背景技术

甲型流感是甲型流感病毒引起的一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。它的传染性极强，极易造成世界范围内的大流行。历史上流感的大流行曾经夺去许多人的生命，据世界卫生组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为6亿～12亿例，死亡50万～100万人，其中重症流感病例300万～500万例，重症流感的病死率为8％～10％。2009年在墨西哥暴发并迅速在全球蔓延的人感染甲型(H1N1)流感疫情目前已造成近10万人感染，上千人死亡，引发全球恐慌。目前仍无特效的治疗流感的方法。又由于其抗原变异性强，宿主范围广，各亚型间几乎没有交叉保护性，使得流感难以控制和频繁爆发。而作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂--中和性抗体，在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制一种针对流感病毒的广谱中和效应的抗体用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。

甲型H1N1病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus A)，其遗传物质为RNA。甲型H1N1流感病毒携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm。猪流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。共编码10个多肽，其中节段1编码PB2蛋白，节段2编码PB1蛋白，节段3编码PA蛋白，节段4编码血凝素(HA)，节段5编码核蛋白(NP)，节段6编码神经氨酸酶(NA)，节段7编码基质蛋白1和2(M1/2)，节段8编码非结构蛋白1和2(NS1/2)。在8个基因片段中最短的是NS1基因。由于HA和NA分子容易发生抗原漂移或突变(每年每核苷突变率为10^-3)，其抗原性表现出很大的变异，而且A型流感病毒亚型众多，各亚型诱导的抗体不能相互交叉保护。

而NS1蛋白是流感病毒NS1基因编码的一种小分子、非结构的RNA结合蛋白，可以编码202-237氨基酸，能与特定RNA序列结合，然后对基因表达的转录后行为进行调节，是一个具有多种活性的调控因子。NS1蛋白只在病毒感染的细胞中合成，并未被包装进病毒颗粒。在病毒感染早期即有大量NS1蛋白表达，其在细胞浆合成后很快转移至核内，并积聚在病毒感染早期的胞核内，在感染后期则聚积于核仁中，形成致密的晶体样包涵体，提示NS1蛋白在病毒复制及早期抵抗机体的抗病毒免疫过程中具有重要作用。反向遗传系统实验证实了NS1蛋白在保护流感病毒抵抗细胞IFN反应中的重要作用，当缺乏NS1基因时，重组病毒A/PR/8/34(H1N1)仅能在细胞IFN反应缺陷时复制。研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记。

绝大多数甲型流感病毒NS1蛋白具有两个比较重要的功能区：A区和B区。A区为氨基端的RNA结合区，NS1蛋白可通过此区与不同种类的RNA包括dsRNA相结合；B区为分子羧基端的效应区，此区可与宿主细胞核蛋白相互作用，抑制宿主细胞核mRNA的运输。通过这两种途径，NS1蛋白可拮抗IFN-α/β，抑制细胞mRNA前体加工和mRNA转运，促进病毒mRNA翻译，增强病毒复制等。因此，拮抗NS1蛋白的功能对于抑制甲型流感病毒复制和限制病毒传播至关重要。

随着抗体库技术的出现，抗体工程进入崭新的发展阶段。通过基因重组技术将抗体分子在基因水平上重组、表达、纯化，可获得多种多样的特异性的人源化抗体，为将来可能的临床诊断、预防和治疗提供可行性的。

发明内容

本发明的目的：是通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒NS1抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床抗甲型病毒药物评价和甲型病毒治疗。