[发明专利]一种制备枯草芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

世界范围每年全世界要生产农药200多万吨，其主要是化学农药，长期 使用化学农药，病原物和害虫易产生抗药性，有些化学农药已被证实有致癌、 致畸、致突变的问题，同时，化学农药残留也制约着农产品的质量。

近年来，生物农药迅速崛起。生物农药是指以细菌、真菌、病毒、线虫 以及由它们产生的代谢物(农用抗生素)为有效成分的农药，生物农药起源于 1960年代，其开发在1970年代曾掀起过高潮，但由于当时生物技术、手段、 水平相对较低，生物农药本身对工艺、贮藏、运输要求又高，及随后拟除虫 菊酯的崛起造成生物农药的开发步入低潮。近年来，随着人类对生存环境质 量的要求越来越高，无公害、无污染、无残留、成本低、且不易产生抗性的 生物农药又重新受到关注。生物技术尤其是微生物技术的进步更为这类农药 的开发提供了便利。目前生物农药销售额达$3亿，约占整个农药市场的1％， 且年产值每年上升10％～20％。

其中，微生物农药是公认的“无公害农药”，防治对象不易产生抗药性、 不伤害天敌，繁殖快，是综合防治农林病虫害的主要手段。随着全球化学农 药公害问题日趋严重，近年来的微生物农药研究备受重视。对枯草芽孢杆菌 的研究应用也成热点。

枯草芽孢杆菌，英文名(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种。 因广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。它通过 营养竞争进行生长繁殖从而占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长， 能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使病原菌得不到生存空间，从而保 护作物免受病原菌危害；枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多 粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，抑制病菌孢子萌发和菌丝生长， 从而达到预防与治疗的目的。可用于果蔬病害、白粉病、灰霉病、水稻稻瘟 病、香蕉叶斑病、橡胶树白粉病和炭疽病等多种作物种传和土传病害。因该 制剂防病机理独特，以菌治菌，所以可用于多种作物病害的防治，均收到优 异的效果。

目前，市场上常见的是枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，多用常规发酵方法如 液体深度发酵制备，即只采用液体培养基对微生物进行培养繁殖，之后经过 过滤、干燥等工艺得到枯草芽孢杆菌母粉，其含枯草芽孢杆菌孢子数大多为 200亿个活芽孢/克，用于防治农作物病虫害用量大，成本高。

发明内容

本发明针对现有技术制备的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂中孢子数太少的 缺陷，提出一种新的制备枯草芽孢杆菌的方法。该方法制备的枯草芽孢杆菌 孢子数可达1×10¹¹个活芽孢/克以上。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1：将第一液体培养基调pH值为6.5～7.5，高温灭菌后冷却至室温， 接种活化的枯草芽孢杆菌菌种，培养20～40小时，得液体菌种备用；

步骤2：将第二液体培养基高温灭菌后冷却至室温，按培养基体积的3％ 接种步骤1所得液体菌种，搅拌并通气，在无菌状态培养24～35小时，得种 子液备用；

步骤3：将麸皮60％-70％、稻草粉20％-30％、玉米粉10％-20％混合均匀配 制成固体培养基，经高温灭菌后，降温至室温，在无菌状态接种步骤2所得 种子液并进行培养；

步骤4：将步骤3的培养基在无菌状态进行固体发酵培养72～90小时， 干燥后，即得到本发明所述高浓度枯草芽孢杆菌。

步骤1所述第一液体培养基优选为马铃薯蔗糖培养基或牛肉汁蛋白胨培 养基，步骤1中最佳培养温度为28～30℃。

步骤2所述通气的通气量优选为1∶1。

步骤2所述第二液体培养基为培养细菌的常规培养基，如玉米粉大豆粉 培养基或玉米粉大豆粉葡萄糖培养基，所述玉米粉大豆粉培养基中玉米粉与 大豆粉重量比1∶2-3，所述玉米粉大豆粉葡萄糖培养基中玉米粉∶大豆粉∶ 葡萄糖的重量比为1∶2∶1。

步骤2中接种浓度优选为0.6×10⁹个芽孢/毫升。

步骤2中最佳培养pH值为7.5～8.5。

步骤3的接种量优选为培养基重量的3％～10％。

步骤4所述干燥优选在室温或低温进行。