[发明专利]乙型肝炎病毒耐阿德福韦变异病毒株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一株耐阿德福韦的乙型肝炎病毒(HBV)变异株，本发明还涉及其检测试剂以及该病毒株在耐药性监测，交叉耐药性分析、药物筛选和新药物的发现等多方面的应用。

背景技术

阿德福韦酯是腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韦(ADV)的前药，口服后可迅速水解为ADV而发挥抗病毒作用。ADV是广谱抗病毒药物，为核苷类病毒逆转录酶抑制剂，通过抑制HBV的复制而发挥抗病毒作用。研究已证实，ADV对HBeAg阳性或HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者均有很好的疗效和安全性。现已作为一线药物应用于慢性乙型肝炎的抗病毒治疗。

与其他核苷类药物一样，ADV治疗中，也会发生HBV DNA耐药突变，从而导致ADV耐药。研究表明，ADV治疗慢性乙型肝炎患者过程中，第1-5年的耐药突变发生率分别为0％、3％、11％、18％和29％。

最常见的ADV耐药突变是HBV聚合酶D区的rtN236T和B区的rtA181V/T。在ADV治疗初期，几种突变可以伴随发生，也可单独出现，但随着疗程的增加，rtA181V常伴随rtN236T而出现。在体外药敏试验中，与野生株病毒相比，rtN236T变异病毒株对ADV的敏感性下降了3.9至13.8倍，而rtA181V变异株下降了2.5至3.0倍。已有多项研究指出，rtN236T的出现改变了复制催化活性区内氨基酸的极性，使得HBV聚合酶的折叠发生了变化，因此在复制阶段不利于其与底物的结合，从而导致复制过程受阻碍。而rtA181V的出现，在一定程度上校正了氨基酸极性上的变化，使得发生rtN236T突变后，聚合酶折叠更接近于原来状态，有利于耐药性变异病毒株的复制传代。此外，体内试验和体外试验的数据均提示，rtA181V变异对拉米夫定的敏感性不及rtN236T变异。这很可能是因为rtA181V变异与拉米夫定的rtL180M相毗邻，所以任何一种变异的发生都会对其产生邻位效应。

突变rtN236T和rtA181V对HBeAg阴性和阳性患者的影响不完全相同。ADV耐药现象在低病毒血症且HBeAg阳性患者中的发生率相当低，耐药的发生也部分体现在ALT的升高上。对于HBeAg阴性的患者来说，ADV治疗48周后停药，治疗获益常在停药1～2年后消失。但若继续用药直至144周，患者在治疗48周时所获得的病毒学、血清生化及组织学等各方面改善，将被保留且进一步好转。期间耐药发生率很低，且负面作用与初始的48周治疗时相似。

目前，ADV也常用于前期拉米夫定治疗失效的患者。早期48周及96周临床试验均提示，无论是野生型还是YMDD突变型病毒株，均对ADV敏感，治疗后HBV DNA下降呈指数趋势，且患者的耐受性良好。故两种药物联合应用更加有效地抑制了病毒的复制，但也可能发生聚合酶区的rtL180M+M204V和rtN236T联合突变，对拉米夫定和ADV产生双重耐药。尽管研究表明，拉米夫定耐药株对ADV敏感，但对HBV本身来说，三种变异联合增加了对ADV的耐药水平，与rtN236T单突变相比，对ADV的敏感性下降了2倍。在分子水平，联合突变导致底物结合位点更难与阿德福韦结合，因此进一步降低了对ADV的敏感性。

迄今为止，学者们发现不但HBV聚合酶基因区的rtA181V、rtN236T变异可引起ADV相关耐药，其他许多与ADV相关的突变，例如rtI233V、rtS85A、rtS85P、rtS119A、rtH133L、rtV214A、rtH234Q、rtP237H和rtN238D等，也可能与ADV耐药有关。然而，仍有许多慢性乙型肝炎患者，在ADV治疗中出现临床耐药，却检测不出已知变异位点的存在。故ADV相关HBV突变的研究还需要进一步的探索。

发明内容

本发明的目的是，找到引起ADV耐药的HBV新变异位点和相应的HBV突变病毒株，提供此新变异位点的检测方法和检测试剂盒，提供相应HBV突变病毒株的鉴定方法和鉴定试剂盒，以及此新变异位点和相应的HBV突变病毒株在筛选抗HBV药物，监测耐药突变等方面的应用。

本发明发现rtE218G突变，即HBV DNA聚合酶区218位的氨基酸密码子由GAG突变为GGG，该突变是与ADV耐药相关的新的HBV基因突变位点。体外表型实验结果显示，rtE218G突变病毒株能够独立引起对ADV的耐药，其IC₅₀是野生病毒株的5.5倍。rtE218G突变株在体外的复制能力有所降低，大约是野生株的87％。