[发明专利]游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) CGMCC No.3212游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的制备方法。

背景技术

目前，国内外L-鸟氨酸的制备方法主要有水解法和发酵法，水解法是以精 氨酸为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到L-鸟氨酸。而发酵法是利用 精氨酸或者瓜氨酸缺陷型的微生物来发酵生产L-鸟氨酸，常用的微生物有：谷 氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌、解烃棒杆菌和大肠杆菌等。由于化学水解法生产 L-鸟氨酸条件苛刻，产物多为DL型外消旋体，分离困难，且大量使用有机溶剂， 给环境带来严重污染；而发酵法生产L-鸟氨酸产量相对较低(国外最高仅有50 g/L左右)，并且发酵液中的杂质多，后续分离困难；采用上述方法生产L-鸟氨 酸成本较高，同时L-鸟氨酸产率不高，给实际推广应用带来了很大困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212游离细胞或固定化细胞多次重复使用，缩短了生 产周期、提高了L-鸟氨酸的产率，降低了L-鸟氨酸的生产成本，使大规模生产 L-鸟氨酸成为可能。其中固定化细胞即采用海藻酸钠包埋法对苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212进行固定化，把固定化好的细胞填充到 填充柱中，然后让含有L-精氨酸的碳酸缓冲溶液以一定的流速流经填充柱。该 制备方法通过选用合适的固定化条件对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) CGMCC No.3212进行固定化，把固定化细胞填充到一定高径比的填充柱中，再 以此填充柱作为催化剂，让含有L-精氨酸的碳酸缓冲液以一定的流速流经此填 充柱，在最佳反应条件下催化合成L-鸟氨酸。该方法具有固定化细胞活性高、 稳定性好、寿命长，产物杂质少，生产周期短、可连续化，工艺操作简单、生产 成本低、操作安全等优点。

本发明分离筛选到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌体在转化生产L-鸟氨酸后可作为Bt生物农药，对鳞翅目昆虫具有高 毒力，而对人畜没有任何的危害。

本发明的整体技术构思是：

游离细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成：

a.将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中 的斜面培养基制成斜面菌种；

b.将斜面菌株扩大培养作为种子液；

c.将种子液接入发酵罐中进行发酵；

d.将发酵完的游离菌体离心后移入L-精氨酸溶液，以L-精氨酸作为底物进行转 化；

e.游离细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。

固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成：

A.将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中 的斜面培养基制成斜面菌种；

B.将斜面菌株扩大培养作为种子液；

C.将种子液接入发酵罐中进行发酵；

D.固定化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞的制备；

E.把固定化细胞填充到填充柱中；

F.把含有L-精氨酸的碳酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-鸟氨酸；

G.固定化细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。

Bt生物农药的制备：

将游离细胞或固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸后的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212湿菌体细胞以一定的质量比与水配成溶 液，喷洒到被保护植被表面，以完全湿润为量。

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤a和步骤A中斜面培养基由下列重量份组分组成：

葡萄糖5-10份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二 钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15-20份和 水1000份；