[发明专利]用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基因分子标记方法，特别是涉及一种用于苹果枝干轮纹病抗性基因的分子标记方法、脱氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作为检测苹果枝干轮纹病抗性基因的PCR探针(寡聚核苷酸引物序列)，属于植物基因工程领域。

背景技术：

苹果为世界性重要的水果，且在我国栽培面积和产量均处于首位。苹果枝干轮纹病是目前我国苹果生产上危害严重、发生普遍的病害之一，是由轮纹病菌(Botryosphaeria berengerianaf.sp.piricola)侵染苹果枝干而引起的。其主要症状是在枝干表面形成许多瘤状突起，突起边缘产生裂缝，似马鞍状，造成树皮粗糙。轮纹病主要危害主干、主枝，严重时也可危害侧枝及小枝。轮纹病斑一般较浅，多造成树势衰弱。在弱树及弱枝上，有时病斑也可深达木质部，导致枝干枯死。近年来，随着主栽品种的更迭，质优但感病的品种栽培面积不断扩大，该病的发生与危害日趋严重，成为苹果生产上的突出问题。目前该病还没有有效的防治办法，另外，化学防治还会影响到使用者的身体健康，并导致一系列的环境问题。因此，利用苹果资源自身的抗性基因，通过杂交育种来培育抗病新品种是解决该问题的根本途径。但通过杂交育种的方法，选育出抗轮纹病新品种的周期较长，因为杂种树的田间发病症状一般要等到盛果期才能观察到明显的症状。这就造成人力、物力、时间上的大量耗费而育种效率低的结果。然而，DNA分子标记技术不仅可以作为性状早期选择的手段，而且也可以作为种质鉴定的辅助手段，大大提高育种效率。我们通过田间杂交群体对苹果枝干轮纹病的抗性分离情况分析表明，该抗病性是受两对隐性基因控制的质量性状。

随机扩增多态性DNA(RAPD)是一项分子标记技术，具有快速、简便、成本低、多态性检测丰富、不需同位素示踪和安全可靠的特点，在分子生物学研究领域及植物育种方面得到广泛的应用，并取得明显成效。将RAPD标记转换成SCAR标记，是解决其稳定性，并适应大规模样品分析的理想途径。

发明内容：

本发明目的是提供一种用于苹果枝干轮纹病抗性基因检测的SCAR分子标记方法，它能解决传统杂交育种中周期长、效率低的问题。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，对苹果品种间杂交F₁代杂种树进行研究，寻找与苹果枝干轮纹病抗性基因连锁的DNA分子标记，研究它的DNA序列组成，合成寡聚核苷酸引物，发展应用成检测苹果枝干轮纹病抗性基因的探针，用于抗枝干轮纹病育种的早期筛选与鉴定。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：a.以苹果品种舞姿、短枝富士及其F₁代杂种88株，其中抗病11株，感病77株为试材，分离提取并纯化基因组DNA；b.采用RAPD技术，用多个随机引物在F1代杂种及亲本DNA上进行扩增，筛选与抗病/感病性状相关的多态性标记，分析标记的分离特点及其与性状遗传规律相吻合情况。c.用玻璃珠DNA胶回收试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收目标DNA片段；d.用美国Promega公司的pGEM-T载体连接回收的DNA片段；e.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用酶切鉴定法判断克隆片段是否正确；f.将阳性克隆的菌液送测序公司测序；g.获得目标DNA片段即RAPD标记片段实际长度及其序列；h.根据序列的碱基组成，人工设计并合成一对该序列的特异寡核苷酸引物；i.对原杂交组合双亲及F1代杂种的基因组DNA进行PCR特异扩增；j.获得特异扩增的多态性DNA片段，即SCAR标记，可用于检测与苹果枝干轮纹病抗性基因相关的基因型。

附图说明：

图1是本发明获得的目标DNA片段即RAPD标记序列示意图；

图2是本发明依据的亲本与后代之间的遗传模式示意图；

图3是本发明的实验结果图。

具体实施方式：