[发明专利]海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP

说明书

技术领域

本发明涉及基因克隆技术领域，特别是涉及海洋细菌新型低温蛋白酶MP。

背景技术

酶制剂产业经历了半个多世纪的起步和迅速发展之后，现已形成一个富有活力的高技术产业，在洗涤、皮革、食品、饲料、制药和纺织等工业领域得到广泛应用。蛋白酶作为一种酶制剂，其市场占有率已经超过了40％。

碱性蛋白酶的应用起源于20世纪60年代，来自地衣芽孢杆菌的Carlsberg丝氨酸蛋白酶首次作为洗涤添加剂被推向市场。由于其不仅能够水解去除衣物上的奶渍、汗渍、血渍等污物，而且与洗涤剂的相容性较好，因此受到了世界范围的酶制剂市场的关注。

随着绿色、环保、节能理念的深入，无磷和低温洗涤已成为一个趋势，它改变了长久以来的洗涤习惯。为了获得更好的洗涤效果，人们不得不提高洗涤液的碱度，同时在洗涤液中添加氧化剂增强洗涤效果，但已有的天然碱性蛋白酶不能很好的适应现有的应用环境。因此，许多国家展开了应用蛋白质工程对现有的碱性蛋白酶进行人工改造的研究，同时从自然界中寻找新的碱性抗氧化蛋白酶。

传统上从自然界中筛选得到的抗氧化蛋白酶OSP(Oxidatilvely Stable Protease)多数来源于陆地的芽孢杆菌属菌株，属于丝氨酸蛋白酶类。

海洋环境不同于陆地，造就的生物具有独特的代谢途径和遗传背景，代谢过程中的酶类在性质、功能上与陆地生物酶有很多不同。欧、美及日本等国每年投入数亿美元的资金，用于海洋酶领域的研究与开发。

目前国内外对天然抗氧化蛋白酶的研究大多数停留在描述基本的酶学性质，得到基因序列的少数蛋白酶都是来自芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶，野生型抗氧化蛋白酶的空间结构仅有一例报道，即丝氨酸蛋白酶KP-43，它有N端和C端两个结构域。N端α/β水解酶结构域是所有枯草芽孢杆菌蛋白酶共有的催化结构域，由11个α螺旋与10个β折叠组成，包括了三个保守的催化残基Asp30、His68和Ser255。催化残基Ser255和形成氧阴离子洞(oxyanion hole)的残基均位于第九个α螺旋上。C端由两个四股反平行β折叠组成jelly roll β桶结构域，C端结构域同酶的抗氧化性无关，与酶自身折叠有关。将正常的KP-43和被过氧化氢氧化的KP-43的晶体比较， 空间结构几乎相同；只有靠近催化残基Ser255的Met251和Met256被氧化成亚砜。

从海洋细菌中分离纯化得到一种低温碱性金属蛋白酶MP，使用pH范围为7-11，0℃冰浴中尚能保持一定活性，是一种适应温度在20-30℃范围内活性基本不变的碱性蛋白酶，其活性不被洗衣粉中表面活性剂所抑制，与氧化漂白剂配伍基本稳定，这些独特性能赋予它在加酶洗涤剂工业、生化试剂以及其它低温工业等领域的广阔应用前景。

应用表明其抗氧化性能与当今洗涤剂市场上经过蛋白质工程改造过的SubtilisinCarlsberg(SC)，Subtilisin Novo(Bacterial Protease Nagase BPN’)，Alcalase，Esperasean和Savinase(SB309)等产品相比还有一定的差距。需要对其进行蛋白质工程改造。

定向进化(directed evolution)是近20年发展起来的一项新的蛋白质改造技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。