[发明专利]益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定性、定量测定方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及含有益生菌的乳制品技术领域。更具体地，本发明涉及一 种在益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的快速定性、 定量测定方法。

【背景技术】

益生乳制品因其丰富的营养价值和特殊的益生功效成为人们关注的 热点。目前市场上益生菌及含有益生菌的乳制品种类繁多，并且每年以高 速度增长。对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、 合理、快速的方法。传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理 生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。传统方法易受培养条 件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，而且受外界环境因素和培养基 性能的影响大，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。PCR技术一 经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时荧光定量PCR (Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免 了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准 确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。 采用乳杆菌种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、 准确的益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的定性、定量测定方法，可以简化益生 菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的检测能力，完善保健 食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。

本发明针对益生菌乳制品中含有的嗜酸乳杆菌，依据参考文献自行设 计嗜酸乳杆菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行 种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分 析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的简 便、快速、准确的定性和定量测定方法。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定性方 法。

本发明的另一个目的是提供一种益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速 定量方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定性测定方法。该 方法的步骤如下：

A、模板DNA的制备

(1)取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500μL TE缓冲 液，混合均匀，再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行 融化4-6min，如此反复进行冻融3-5次；

(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL 10％(质量体积比)的SDS和 10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动 4h；

(3)加入100.0μL 5M NaCl和100μL CTAB/NaCl(将4.1gNaCl溶于 80ml水中，再缓慢加入10g CTAB得到的溶液)，65℃水浴10min。

(4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异 戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离 心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；

(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇 混合物抽提一次，分离上清液；

(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积 的冰异丙醇，混合均匀静置30min，以10000g/min离心5min得到总DNA 沉淀；

(7)所述沉淀用70体积比％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然 干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下 保存备用。

B、PCR扩增

反应体系25.0μL：2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg²⁺、2μL 2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板， 0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性40S，57℃退火30S，72℃ 延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃ 下保存；