[发明专利]益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法

权利要求书

1.一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、模板DNA的制备

(1)取益生菌干酪乳样品于2.0mL离心管中，加入500.0μL TE缓冲液，混合均匀，再置于液氮中进行完全冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行融化4-6min，如此反复进行冻融3-5次；

(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL 10％(质量体积比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动4h；

(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL 10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；

(4)加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；

(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次，分离上清液；

(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，混合均匀，再静置30min，以10000g/min离心5min，得到总DNA沉淀；

(7)所述沉淀用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下保存备用；

B、PCR扩增

反应体系25.0μL：2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg²⁺、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性40S，62℃退火30S，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃下保存；

取3.0μL PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测；

所述的上下游引物分别是：

上游引物Cf为5’-CACCGAGATTCAACATGG-3’，

下游引物Cr为5’-GAAGGGCGGAAACCCTCC-3’，扩增片断长度为784bp；

C、结果及判断

检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在784bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有干酪乳杆菌，相反地则不含有干酪乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于含有目的扩增片断的质粒DNA是通过将L.casei ATCC 393的PCR产物与pMD18连接转化大肠杆菌DH5α获得的阳性克隆子。

3.一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、样品总RNA的制备

采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA：发酵样品500mg在盛有液氮的研钵中研磨后，迅速加入1mL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪测定浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后将样本保存于-80℃；

B、反转录扩增

反应体系10.0μL：2.0μL 5×PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、0.5μL PrimerScript RT Enzyme Mix I、0.5μL Random 6mers(100μM)、TotalRNA(＜500ng)，RNase Free dH₂O补足至10.0μL；

反转录扩增反应条件：37℃反应15min；85℃变性5S，在温度-20℃下保存；

C、实时荧光定量PCR

反应体系25.0μL：Premix Ex Taq^TM，各0.5μL 10μmol/L上、下游引物Cf和Cr，2.0μL cDNA模板，9.5μLdH₂O；

荧光定量PCR反应参数：95℃变性25S；95℃变性10S，60℃退火22S，40个循环；每个样品重复3次；在温度4℃保存；

所述干酪乳杆菌种属特异性引物序列如下：

上游引物Cf为5’-CACCGAGATTCAACATGG-3’，

下游引物Cr为5’-GAAGGGCGGAAACCCTCC-3’，扩增片断长度为784bp；

D、外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：提取含有以干酪乳杆菌模式菌株ATCC393目的扩增片断的质粒DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行10倍系列稀释，梯度稀释至10⁹-10²拷贝数/uL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；

标准曲线的绘制：以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；

E、结果及判断

以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行干酪乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值求出益生菌乳制品中干酪乳杆菌的起始模板量。