[发明专利]循环“连接－延伸”基因组测序法

说明书

技术领域

本发明涉及基因测序技术，尤其是一种循环“连接—延伸”基因组测序法，属于生物医学技术领域。 

背景技术

现有基因测序技术有以下几种 

1、焦磷酸测序法(Pyrosequencing) 

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。它可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。但是，与此同时，焦磷酸测序技术可以检测核苷，但是会出错，因为这项技术很难区分单一碱基和一串类似的相邻碱基之间的不同，其运用具有一定的局限性。 

2、Solexa测序技术 

将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片断，在片断的两个末端加上接头，利用专利的芯片：其芯片表面连接有一层单链引物，DNA片断成单链后通过芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上，引物扩增使得单链DNA成为双链，该双链变性后成为单链，其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”。这样的反应在上千万DNA单分子上发生，形成的单链桥以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增，经过30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇群”。“DNA簇群”在Genome Analyzer综合分析仪上进行序列分析。序列合成反应体系包括有引物、DNA聚合酶、4种标记了不同荧光的核苷酸，每个核苷酸的碱基被保护基团封闭。每次反应掺入一个核苷酸，该核苷酸类别可通过标记荧光进行识别，经过扫描，读取该次反应颜色后，位于碱基末端的保护基团被除去，继续下一轮反应，如此反复，得出片段的精确序列。该技术读长为30-35个核苷酸。 

3.SOLiD测序技术 

SOLiD测序技术中首先将DNA经物理方法处理成几百碱基左右的片段，两端与接头相连接，与Adaptor相连的DNA片段和固定有与接头序列互补序列的磁珠混合后，进行Emulsion PCR。PCR扩增结束后，将变性DNA单链与磁珠移至载玻片上。 

连接法测序：测序引物与接头可以互补杂交，其5’端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接(该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点)。当其标记颜色被读取后，即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断，以移除标记，进行下一轮反应，依此循环。在第一轮反应中，可以得到确定的碱基位点为：4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程，偏移一位碱基，使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应，可以确定的碱基位点包括：3、4、8、9、13、14等，如此往复，直至偏移至引物的第一个碱基(即待测序列0位点碱基)。由于该位点碱基已知，可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型，然后，又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型，依此类推，直至整个序列读序完成。此技术目前的读长为30至35个碱基。 

SOLiD System Overview的测序原理及其特点 

目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454(GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。