[发明专利]共表达阴离子配体生产重组阳离子抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体是一种共表达阴离子配体生产重组阳离子抗菌肽 的方法。

背景技术

阳离子抗菌肽(英文名cationic antimicrobial peptides，AMPs)，是一类带净正电 荷的两性小分子多肽，在动物、植物和微生物中广泛存在，其杀菌谱宽、免疫原性低；阳 离子抗菌肽与细菌细胞膜作用，在膜上形成离子通道，引起细胞内含物外渗而死亡，对于 这种独特的杀菌机制不易产生耐药菌株。而由于动物细胞膜成分与细菌细胞膜成分在电荷 等方面存在差异，阳离子抗菌肽对动物细胞的毒性通常较小。在当前耐药性问题日趋突出、 对新药物的需求十分迫切的背景下，抗菌肽在医药、农业、食品、国防等领域显示出诱人 的应用前景。

阳离子抗菌肽在生物体内含量极微，如果利用生物化学的方法从生物体内提取天然抗 菌肽，得率低，成本高；如果用化学合成法，目前价格昂贵，片段较长更是如此。这些问 题限制了对抗菌肽的研究和实际应用。基因工程生产阳离子抗菌肽是一条有效途径。但由 于阳离子抗菌肽基因序列的差异、对宿主细胞的毒性和分离纯化效率等问题，还需要针对 不同抗菌肽分子研发相应的高效重组表达技术，这是当前国内外重点研究内容之一。

在基因工程生产技术中，以大肠杆菌为代表的原核表达系统成本低，一直是首选的表 达方法。阳离子抗菌肽对于大肠杆菌宿主细胞有毒害作用，为原核重组表达带来特殊的难 题，若以非融合的方式直接表达，则表达产物损伤宿主细胞，反过来影响表达产量。所以， 一般通过与阴离子片段融合表达以抑制表达过程中对宿主细胞的毒性，但融合表达后需要 切除融合头以恢复活性，才能获得有活性的重组阳离子抗菌肽。目前常用的切除融合头的 方法，主要有溴化氰化学切割法以及酶切法两种。若用溴化氰切割，要求目标阳离子抗菌 肽本身不含有甲硫氨酸，且溴化氰本身也为有毒物质，还可能产生抗菌肽的化学修饰等问 题；酶切法则需要昂贵的特异蛋白酶、切割后留下多余的氨基酸残基(重组生产的不同药 物可因此带有相同的多余氨基酸残基，重复交叉使用会引起免疫反应影响药效)、以及还 存在非特异性切割干扰。总之，化学切割法与酶切法在生产实际中都存在较大的限制和缺 陷，对基因工程生产阳离子抗菌肽形成了较大的制约。

发明内容

为克服当前基因工程生产阳离子抗菌肽技术存在的上述缺陷，本发明提供一种新的 方法，能够缩短生产周期，简化生产程序，降低生产成本，提高表达产量，并省去切割融 合头这一步骤。其特征在于在表达阳离子抗菌肽的同时，共表达一个阴离子配体；阳离子 抗菌肽与阴离子配体在同一个宿主细胞内各自独立表达，阴离子配体与目标阳离子抗菌肽 的关系是非融合的，是反式的。使用改进后的技术，阴离子配体可以中和阳离子抗菌肽对 宿主细胞的毒性，从而提高了表达产量；且由于阴离子配体和阳离子抗菌肽之间没有共价 键连接，在表达后的分离纯化中，不再需要任何切割处理，直接用阳离子交换树脂纯化即 得到纯度较高的抗菌肽，提高了纯化效率和得率。

本发明的技术方案为：

共表达阴离子配体生产重组阳离子抗菌肽的方法，其特征在于：在基因工程生产阳离 子抗菌肽的过程中，同时表达一个独立的阴离子配体，所述的阴离子配体是一段带净负电 荷的氨基酸序列；也就是将阳离子抗菌肽基因与编码阴离子配体的DNA序列克隆至质粒载 体，在大肠杆菌宿主细胞内诱导共表达；表达得到的阴离子配体可抑制阳离子抗菌肽对宿 主细胞的毒性；阴离子配体与阳离子抗菌肽之间是非融合的，无共价键连接。

所述的方法，其特征在于：阳离子抗菌肽是指带有净正电荷的具有抗菌活性的多肽。

所述的方法，其特征在于：所述的克隆与转化，可以使用一个共表达质粒载体，将阳 离子抗菌肽基因和编码阴离子配体DNA序列分别插入到该载体的两个多克隆位点，转化大 肠杆菌感受态细胞，诱导共表达；也可以使用两个不同的表达载体，它们分别携带不同的 抗生素抗药性基因，将阳离子抗菌肽基因和编码阴离子配体DNA序列分别克隆到这两个载 体，共转化大肠杆菌感受态细胞，用同时含两种抗生素的培养基筛选和培养细胞，诱导共 表达。

所述的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌及质粒载体可以由酵母及其相应的质粒载 体替代。

技术方案所依据的科学原理：