[发明专利]利用萌发种子胚芽鞘转化外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因转化的技术。它是以萌发种子的胚芽鞘作为胚芽生长点生长发育的生理形态指标，采用注射或切割方法使农杆菌侵染转化胚芽生长点细胞，实现将外源基因导入受体细胞，获得转基因植株，为此本发明属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物基因工程技术是利用现代基因分子生物学理论进行遗传育种的重要途径。然而，基因转化率低，重复性差，效率不高，一直是影响其产业化推广应用的瓶颈，也是世界各国研究的热点。本发明为解决此难题提供一项新的技术。

迄今植物基因转化建立三大技术体系，二十多种转化方法(植物基因工程2004年科学出版社北京)。自Zambrysk等1983年(EMBO J₂，2143-2150)采用农杆菌转化系统获得世界上第一株转基因植株以来，大量的研究表明，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒转化系统是机理最清楚，技术最成熟的基因转化技术。其缺点是转化率低，重复性差，要在无菌操作的植物组织培养基础上进行，难以实现规模化和产业化。如何使农杆菌转化技术扬长避短，融合各转化技术的优点，研究出一种新的转化技术，促进其产业化进程，是世界各国关注的问题。

通过生物自身的种质细胞为媒体，进行基因转化的体系称之为种质转化系统。在种质细胞中种子胚芽生长点细胞生命力最强，分裂最快，最能实现细胞全能性的转化受体细胞。Hess早在1969年(Z.Pflanzenphysiol，98：321-327)用外源DNA浸泡矮牵牛种子获得了转基因植株证实了这一结论，推动了该领域内的研究进展。

禾本科植物种子萌发时，胚芽鞘是最早萌动的封闭性结构，把胚芽生长点包裹在胚芽鞘腔内起保护作用。胚芽鞘生长迅速，首先突出地面，随着胚芽的生长发育突破胚芽鞘长成幼苗。胚芽鞘的长短标志着胚芽生长发育的生理形态阶段。胚芽鞘的无菌腔是胚芽生长发育的内环境。因此，充分利用胚芽鞘的结构功能对基因转化的操作是十分有利的。

本发明充分利用种子萌发时胚芽鞘的结构特点，以胚芽鞘的长度作为胚芽发育的生理形态指标，以胚芽鞘腔作为转化的内环境，同时以胚芽鞘内的胚芽生长点作为转化受体细胞，并与农杆菌转化机理有机的结合起来，建立一种新的基因转化方法，故而称之为“胚芽鞘基因转化法”。

发明内容

本发明的目的是提出一种新的基因转化方法。该方法基本内容是应用农杆菌基因转化机理，以胚芽生长点细胞为侵染转化的受体细胞，采用胚芽鞘萌发长度作为胚芽生长发育阶段的生理形态指标及采用注射或切割方法损伤暴露生长点，使农杆菌侵染转化胚芽生长点细胞，获得转基因植株，从而建立一种简便、高效的基因转化方法，简称为“胚芽鞘基因转化法”。

本发明的基因转化技术内容有以下几个方面：

1.在种子萌发时以胚芽鞘作为胚芽生长发育阶段的生理形态指标。当胚芽生长点发育到第1-3个新叶原基形成期时，胚芽鞘长度约1-3cm，此时为基因转适宜期。以胚芽鞘腔或胚芽鞘池作为农杆菌转化共培养的内外环境。

2.采用胚芽鞘微针注射方法，用微量注射器吸取已活化培养好的农杆菌菌液0.1ml，将直径0.1-0.25mm的针头垂直从胚芽鞘顶部穿透胚芽鞘刺入胚芽生长点，使其造成生长点1处或多处细胞损伤，同时将菌液注入生长点和胚芽鞘腔内，进行基因转化共培养。

3.也可以不采用注射法，而采用双面刀在胚芽鞘基部胚芽生长点上1-3mm处横切断胚芽鞘，使其暴露并用微量注射器针头刺伤生长点的细胞，然后将微量注射器中的农杆菌菌液滴在生长点上。由于切割处略高于生长点及胚芽鞘迅速生长，包围菌液形成胚芽鞘池，以利于农杆菌共培养转化。

4.采用2或3操作通过农杆菌与胚芽生长点受体细胞共培养转化后，损伤种质细胞迅速分裂和分化，使胚芽继续生长发育穿破胚芽鞘，生长成幼苗。实验表明由于滴入农杆菌量甚少，不需要脱菌处理，会自行死亡。

5.由于在表达载体构建时已将目的基因与抗除草剂基因连锁，并作为筛选基因，因此当幼苗长到3-5叶期，只要向幼苗叶片喷洒除草剂，能抗除草剂的植株为初选转基因植株。把初选转基因植株种植田间，收获的种子进行基因水平的检测，鉴定出转基因植株。

本发明的主要创新技术特征如下：

①本发明巧妙地利用胚芽鞘作为胚芽生长发育阶段的生理形态指标，胚芽鞘腔和胚芽鞘池作为农杆菌转化共培养的内环境，有利于提高基因转化率。

②发明采用胚芽鞘微针注射或横切胚芽鞘损伤生长点细胞，并把农杆菌菌液注入损伤的生长点，在胚芽鞘腔和胚芽鞘池中进行转化共培养，提高转化机率，因此把此方法称之为“胚芽鞘基因转化法”。