[发明专利]一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物的快速筛选方法，尤其涉及一种降胆固醇乳酸菌的快速筛选方法。

背景技术

根据世界卫生组织公布的1996年度卫生统计年鉴，全球因心血管疾病死亡1530万人，占总死亡人数的29％，心血管疾病因此而高居世界五大死因之首，而它们共同的病理基础都是动脉硬化。动脉粥样硬化由许多因素促成，其中最重要的危险因素是高脂血症即血胆固醇和血甘油三脂的升高。因而，保持血液中胆固醇浓度在正常范围内，对于预防动脉粥样硬化和心脑血管疾病是至关重要的。

美国、我国国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为250-300mg/d/人。但随着人民生活水平的不断提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。据上海市心血管病研究所在1997-1999年间对3467名上海居民的调查，由于每日的营养摄取量比20世纪70年代有明显增加，脂肪由24.1％增至31.8％，胆固醇由282mg上升至388mg，而碳水化合物则由65.7％降至53.7％，上海人的血脂则明显增高。因此研究不影响食品风味，经济实用的降低食品和人体血清胆固醇的方法，己成为当前改善食品质量、提高人们生活水平重要的研究课题。

国外对降胆固醇乳酸菌的研究起步较早。1977年，Gilliland对肠道乳杆菌降胆固醇作用进行了研究，提出乳杆菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。随后Rasic等也证实了嗜酸乳杆菌和两双歧杆菌对胆固醇的脱除作用。迄今为止人体及动物实验也证明了乳酸菌的降胆固醇作用。一些天然的微生物种群包括许多乳酸菌和双岐杆菌，被发现有解离结合胆盐能力，它可以把结合态的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐，在此过程中，关键酶就是胆盐水解酶，该酶的功能性基因为BSH。胆盐水解酶是乳酸菌降胆固醇的关键酶，因此，利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛 选，几小时可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。以往的降胆固醇乳酸菌筛选采用传统的筛选技术，筛选工作周期长、工作量大，选育高性能乳酸菌菌株尤如大海里捞针。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法。

具体内容如下：

(1)菌株PCR扩增

取经初步分离纯化的乳酸菌，挑取单个菌落到0.2mL PCR管中，加入10μL无菌1×TE缓冲液混匀，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min，循环2～3次，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作为PCR扩增的DNA模板；然后按照下列反应条件进行PCR扩增：

第一次变性反应          94℃        5min

35个循环反应    变性    94℃        1min

退火    56～58℃    1min

聚合    72℃        1～2min

末循环                  72℃        1～2min

PCR体系成分表如下：

PCR体系成分表中所述的一对上下游引物1、2，是根据GeneBank现已收录的乳酸菌BSH基因全序列，用vectorNTI软件设计上下游一对引物BSHPf和BSHPr，其中：

引物1BSHPf：5’-GGTTA CGATT ACGCC TAGAA AATAT CC-3’

引物2BSHPr  5’-TTAAT TCAGT CGTAT CCAAG TGCTC ATG-3’

(2)电泳实验分析

具有胆盐水解酶(BSH)基因的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带，根据电泳图谱分析，即可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。

上述的初步分离纯化的乳酸菌可以通过下述方法得到，但不局限于下述的方法，而应当涵盖了现有技术中的任何一种能够获得纯化的乳酸菌的方法：

1、乳酸菌的富集培养

选择适量的酸奶、干酪等富含乳酸菌的食品为富集样品，加入到脱脂牛乳培养基或MRS液体培养基中进行富集培养，37℃培养48h后，用作分离样品。

所述的脱脂牛乳培养基：10克脱脂乳粉加入到100ml蒸馏水中，112℃灭菌20min。

所述的MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄ 2.0g，NaOAC 5.0g，MgSO₄ 0.2g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，蒸馏水1000mL。