[发明专利]早幼粒细胞白血病PML蛋白单克隆抗体的制备及应用

说明书

技术领域

本发明公开一种可特异性识别人早幼粒细胞白血病蛋白(PML蛋白)的单克隆抗体的制备方法，该单克隆抗体可用于检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合蛋白，属于生物基因工程和医学领域。

背景技术

早幼粒细胞白血病基因(PML基因)位于染色体15q22上。其表达产物PML蛋白，属于锌指类DNA结合转录因子家族成员，主要由富含半胱氨酸的锌指结构区、α-螺旋卷曲结构区和丝氨酸/脯氨酸富集区组成。其中，锌指结构区由“ring finger”结构和两个B-box(转录因子结合域)结构组成，是PML结合DNA的重要结构域；α-螺旋卷曲结构区是形成蛋白二聚体所必需的；丝氨酸/脯氨酸富集区的功能与一些基因的转录活性片段相似。

近年来，大量研究表明PML蛋白与许多肿瘤抑制剂有相似的特征，即PML蛋白控制着细胞的增殖、肿瘤基因及造血细胞的分化，PML基因及其表达的PML蛋白在许多肿瘤的发生中起重要作用。在急性早幼粒细胞白血病的发病过程中，PML基因与位于17号染色体的视黄酸α受体基因(RARα基因)发生t(15；17)染色体易位，形成PML-RARα融合基因。此融合基因表达的PML-RARα融合蛋白可阻断骨髓干细胞的正常分化和凋亡，导致急性早幼粒细胞白血病的发生。

本发明采用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达PML重组蛋白，重组蛋白经酶切和纯化后免疫BALB/c小鼠，制备抗人PML的单克隆抗体，该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋白，可用于检测PML-RARα融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

发明内容

本发明说明了一种可特异性识别人PML蛋白的单克隆抗体的制备方法。

本发明选择了PML蛋白锌指结构域中“ring finger”结构区的一段氨基酸序列，通过分子克隆的方法将其在大肠杆菌中表达。

本发明涉及：从人粒细胞白血病细胞系(HL60)中，通过RT-PCR方法获得一段PML基因，将其克隆入pET32a载体中，在大肠杆菌中表达PML蛋白，将此重组蛋白经酶切和纯化后免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，制备腹水，从腹水中提纯抗人PML单克隆抗体。该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋白，可用于检测PML-RARα融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

附图说明

图1是经RT-PCR获得的一段PML基因片段及重组载体pET32a-PML的双酶切鉴定结果。1：PML基因片段的PCR结果；2：Marker DL2000；3：MarkerDL2000；4：pET32a-PML双酶切结果。

图2是Trx-PML融合蛋白经IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳(12％)，酶切后PML蛋白的纯化结果及免疫印迹鉴定结果。1：pET32a-PML诱导结果；2：pET32a空载体诱导结果；3：蛋白Marker；4：蛋白Marker；5：Trx-PML融合蛋白酶切去除Trx后的纯化结果；6：酶切并纯化后PML蛋白的免疫印迹结果。

图3是本发明中的PML单克隆抗体的western-blot鉴定结果。1：NB4细胞(人早幼粒细胞白血病细胞系)裂解液检测；2：HL60细胞裂解液检测。

图4是用NB4细胞对本发明中PML单克隆抗体进行间接免疫荧光染色鉴定的结果。

图5是用HL60细胞对本发明中PML单克隆抗体进行免疫细胞化学染色鉴定的结果。

图6是本发明的实施流程。

具体实施方式

经过深入而广泛的研究，本发明已经成功构建了PML基因，表达、纯化和鉴定了PML蛋白，以纯化的PML蛋白免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，制备腹水，从腹水中提纯抗人PML单克隆抗体。该单克隆抗体可特异性识别人PML蛋白，可用于检测PML-RARα融合蛋白，为急性早幼粒细胞白血病的诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：PML基因的构建和蛋白表达

1.PML基因的扩增