[发明专利]红法夫酵母菌株的复合诱变方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种红法夫酵母菌株的诱变方法，尤其涉及通过低温复合诱变获得红法夫酵母诱变高产菌株的方法。

背景技术

虾青素(Astaxanthin)为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’胡萝卜素，是一种酮式类胡萝卜素。色泽为艳丽红色，具有脂溶性。虾青素具有许多其它的生理功能，如具有高度猝灭单原子氧和清除自由基的作用；抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力比β-胡萝卜素高10倍，比维生素高100倍，可有效地防止组织。细胞和DNA被氧化损伤，增强免疫功能，抗癌作用，保护心血管健康等。虾青素作为功能色素在医药、食品、饲料及化妆品等工业中具有广阔的应用前景，近年来受国内外研究人员和各行业的关注。

目前国际市场的价格为每千克2500美元，全球每年有10亿以上的市场容量。因此，加紧虾青素产品的开发，特别是天然虾青素产品的生产，具有很高的市场价值和十分广阔的市场前景。现在，天然虾青素所占的市场份额很小。就目前的生产和市场情况而言，天然虾青素由于产量低、生产成本高而很难与化学合成的虾青素在价格上进行竞争。但是随着生产技术的改进和优化以及生产成本的降低及公众文化素质的提高，认可并要求购买含天然虾青素的水产品或立法上要求使用天然色素添加剂，天然虾青素与合成虾青素相比就具备了一个特殊的价格优势。

红法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作为虾青素生物来源的一些必要特征：虾青素是主要的类胡萝卜素，大约占到40-95％，能够利用多种糖作为碳源进行异养代谢；培养时间短；不需要光照；能够在发酵罐中实现高密度培养。因而红法夫酵母被认为是一种最具研究价值的虾青素大规模生产的来源。

红法夫酵母中虾青素的含量虽然是甲壳类动物虾青素含量的5-50倍，但只有雨生红球藻中虾青素含量的1％-10％，要想利用红法夫酵母来进行虾青素的工业化生产，选育高产菌株是应用的关键。

附图说明

图1是本发明所采用技术方案流程示意图。

发明内容

本发明的目的旨在通过复合诱变得到一株遗传性状稳定的高产虾青素菌株，为红法夫酵母发酵生产虾青素的工业化奠定基础。

为了达到上述目的，本发明一种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，包括如下步骤：

S1、取红法夫酵母种子培养液，稀释后涂平板；

S2、一次紫外诱变：在黑暗环境下，用紫外灯照射平板后，在20-25℃下培养4-5天；

S3、二次紫外诱变：筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，重复涂平板及步骤S2；

S4、低温处理：筛选色素产量高且遗传稳定的菌株，制得种子液，保存于1-5℃环境下2-4天；

S5、单线态氧处理：将种子液转移到发酵培养基中培养至对数生长中后期，提取菌株的单细胞状态，分别加入浓度为10-15mmol/L的H₂O₂，振荡混匀后置于1-5℃环境中培养10-18小时；

S6、单线态氧处理后的菌株，经洗涤、稀释后涂平板在20-25℃下培养7-10天。

优选方式下，本发明红法夫酵母菌株的复合诱变方法，在上述步骤S5中，菌株培养至对数期的方法为：将菌株从斜面移到发酵培养基中培养36-60小时，再转入新鲜液体培养基培养24-48小时，至对数生长中后期。在上述步骤S5中，提取菌株的单细胞状态的方法为：用无菌离心管取1毫升菌液，以3500转/分钟离心5分钟收集菌体，用缓冲液洗涤两次，再用缓冲液还原到原体积，在漩涡振荡器上振荡20-30秒，使菌体散开成为单细胞状态。

此外，优选方式下，步骤S1的具体过程为：将筛选培养基加热灭菌后，趁热倒平板，15-20ml/板，凝固待用；取红法夫酵母种子培养液，用灭菌水稀释10⁵-10⁷倍，量取稀释液涂平板。而制平板的培养基优先选用：葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麦芽汁3克，琼脂20克，水1升；灭菌冷却至45℃后，加入适量经过过滤除菌浓度为50-80μmol/L的二苯胺溶液。

优选方式下，紫外诱变的具体过程为：用15w的紫外灯在距离20cm处照射，照射时间为10-100秒。此外，本发明上述步骤S1-S6过程中，选用无菌水进行稀释；缓冲液优先选用pH5.0的0.2mol/L磷酸。

而上述步骤中的筛选方法，包括如下步骤：

S31、经诱变培养完后，用肉眼观察，在筛选平板中选取菌落较大颜色较红的单菌落，用接菌环挑取涂到斜面培养基中培养保存；

S32、复筛：将初筛的菌种发酵培养，测定其生物量和色素含量，选取其中色素产量最高的菌种。