[发明专利]人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法。

背景技术

当前社会，病毒感染性疾病十分常见且严重危害人类健康。现有的抗病毒药物主要包括传统广谱性抗病毒药和针对某些病毒的特效药。然而，传统抗病毒药常因为毒副作用大或疗效不显著等原因，使其应用受到限制；而那些通过抑制病毒专有酶或复制关键环节的抗病毒特效药，尽管早期应用时疗效突出，但由于作用于病毒上的靶点较为局限，所以在使用过程中容易出现因作用靶点突变而导致病毒耐药及停药后复发现象。因此，寻找高效、低毒且不易使病毒产生耐药的新型抗病毒药物，对病毒感染性疾病的防治具有重要意义。

近年来，人们在研究哺乳动物、昆虫等防御和抵抗病原微生物侵袭及感染的过程中发现了一种内源性阳离子肽-防御素。有生物活性的成熟防御素分子一般在3-6kD，除富含精氨酸外，其分子内还存在着6个保守半胱氨酸，形成3个链内二硫键。根据二硫键的组成方式，人体内的防御素又分为α和β两种主要类型，目前已发现的人α防御素共有6种，它们分别是由单核细胞表达分泌的HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4和由肠道潘氏细胞及生殖道粘膜上皮分泌的HD5、HD6。由于防御素是一种内源性分子，本身具有识别病原微生物与机体正常细胞的能力，所以在有效剂量范围内不会对人体正常细胞产生毒性，而且病原体也很难对其产生耐药性。

人们对防御素的最初认识是基于其显著、广谱的抗菌作用。但后来研究发现，除了抗菌活性外，大部分防御素还具有一定的抗病毒作用。然而，尽管许多防御素都显示出一定程度的抗病毒作用，但与抗菌作用相比，它们的抗病毒能力相对较弱。Tanabe等(Tanabe H et al，J Virol，2004，78：11622-11631)发现大部分α防御素抗病毒时的半数有效浓度(IC50)要比抗菌时的IC50高10倍甚至上百倍以上。这就意味着当应用防御素进行抗病毒治疗时其用量要显著增加，如此不仅会加重病人的经济负担，更重要的是会超出人体正常细胞对它的耐受力，引发毒副反应。因此，若能显著提高防御素的抗病毒能力，将会进一步提升其在病毒感染防治中的应用价值。

由于不同种类防御素的分子结构十分相似，尤其是半胱氨酸数目、位置以及精氨酸组成都显示出很强的保守性。因此，人们普遍认为所有哺乳动物的防御素都源自于相同的祖先，之所以出现不同种类、不同性状与功能的防御素是由于体内分子进化和选择的结果(Partil A et al，Physiol Genomics，2004，20：1-11)。有研究发现，当对一些防御素进行结构改变或氨基酸置换后，它们的生物学特性(包括抗菌及抗病毒活性)就会发生相应的变化(Xie Cet al，JBio Chem，2005，280：32921-32929)。Lynn等(Lynn DJ et al，Mol Biol Evol，2004，21：819-82)在对人以及恒河猴、小鼠、大鼠等哺乳动物α防御素的进化情况进行分析时发现，在成熟人α防御素分子中有14个位置的氨基酸可以发生适应性进化改变，也就是说，在不同环境和选择压力情况下这14个位置的氨基酸组成会产生相应改变，从而造就出不同生物学性状的α防御素。防御素之所以具有突出的抗菌活性，推测可能是在自然进化过程中其周围环境长期存在细菌压力作用的结果。相对而言，HSV、HPV、HIV等病毒出现较晚，尚未对防御素进化产生长期、显著的环境压力，所以其抗病毒作用相对较弱。因此我们设想，如果对人α防御素分子中可适应性进化的氨基酸进行突变和抗病毒活性筛选，极有可能使其抗病毒能力得到进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法。所述方法通过突变与筛选，使人α-防御素分子在保留其基本生物学特性的基础上，抗病毒能力显著提高，为寻找和研制高效、低毒抗病毒药物开辟一条新途径。

本发明的技术方案：

人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，有以下步骤：

1)人α-防御素突变体cDNA文库的构建：

A.选择人α-防御素分子中具有适应性进化潜能的氨基酸位点作为突变位点；

B.通过DNA合成和PCR扩增获得编码人α-防御素突变体的cDNA片段；

C.构建含有人α-防御素突变体cDNA片段的质粒文库；

2)人α-防御素突变体在CHO细胞中的定点整合与均一性表达：

A.特定CHO细胞的培养：

复苏并传代培养染色体上带有FRT位点的Flp-In-CHO细胞；