[发明专利]一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备转基因猪的新技术。

背景技术

精子介导基因转移方法是目前获得转基因猪简单而高效的方法之一。该方法在小鼠、猪等动物上有过成功的报道，但随后的研究中，由于转基因的效率低而一度引起争议，且不同的实验室报道的结果差异很大，存在外源基因整合效率差的问题。

慢病毒被认为是制备转基因猪的新型优良基因转移载体。慢病毒即能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，可从生殖细胞到囊胚期各发育阶段转移外源基因。目前利用慢病毒载体感染动物胚胎、受精卵以及精原干细胞成功了生产转基因鼠、羊、牛、猪、鸡、鱼等动物。

大量研究证实精子和慢病毒是基因转移的理想载体，但是有关慢病毒和精子共孵育制备转基因猪的研究国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法。

一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，包括如下步骤：慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；然后经人工授精雌性动物，在子代动物筛选转基因猪。

一种慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法，包括如下步骤：慢病毒载体与精子共孵育后，使精子吸附慢病毒载体；经体外受精，体外培养后胚胎移植，获得转基因猪。

在上述慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法中，所述慢病毒与精子共孵育的方法为：动物精液稀释液洗去精清，取洗去精清的精子于人工授精瓶中，加入慢病毒液，盖紧放于17℃保温箱120min，其间每15min轻轻翻动精液瓶，防止精子沉淀聚集，送配种前10min检验活力，其活力达到0.5以上可进行人工受精。

在上述慢病毒与精子孵育制备转基因猪的方法中，所述人工授精的方法为：选健康雌性动物，于发情当天肌注人类绒毛性腺激素，肌注后进行人工输精。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用慢病毒与精子共孵育的技术，通过精子吸附慢病毒后再人工授精或体外受精，将慢病毒导入受精卵中，并将外源基因整合到胚胎基因组中，从而制备转基因猪。从而克服了精子吸附裸DNA介导转基因猪整合率非常低、遗传不稳定等问题。该方法的突出特点是结合了慢病毒与精子载体的各自优点，操作简便、成本较低。利用慢病毒载体与精子孵育，是一种低成本、操作简便、转基因效率较高的转基因方法。

附图说明

图1为转基因仔猪eGFP荧光观察图。

图2为人工授精PCR检测转基因仔猪电泳图。

1-8为仔猪样品；除3号外，其它均能检测到基因的存在。

图3为人工授精PCR检测阳性转基因仔猪的Southern blot结果图。Control为已知阳性结果，阳为阳性仔猪杂交结果。

具体实施方式

实施例1慢病毒载体包装

用293T包装细胞制备慢病毒载体。在质粒DNA共转染293T细胞前24h，消化传代293T细胞，接种6×10⁶个细胞。质粒转染前2～3h，更换细胞培养基，添加新鲜培养基。根据质粒DNA的浓度以及转染细胞的数量计算出每种质粒的需要量(包装质粒6125μg、转移质粒6125μg和外膜质粒2150μg)。培养8h后，更换新鲜培养基。分别在转染后的第1、第2和第3天采取完全更换新鲜培养液和不更换培养液两种方式收集制备病毒载体，并测定载体滴度。收获不同批次制备的病毒载体，采用大量制备试剂盒过滤后，高速梯度离心收集，于-80℃保存备用。

实施例2转基因猪的制备

1、猪精子与慢病毒载体的共孵育

猪精液稀释液(Swine Fertilization Medium，SFM)的配制：11.25g无水葡萄糖10g二水柠檬酸三钠4.7g二水乙二胺四乙酸二钠3.25g一水柠檬酸6.5g三羟甲基氨基甲烷加双蒸水定容1升，最后加入6g牛血清白蛋白(BSA)，现配现用。

(1)确定与配公猪，检验精液品质，最近三次记录合格目活力达到0.7以上。选择试验当天所采长白猪精液中精子活力最高的那份精液，收集精液中浓稠的部分5mL到15mL离心管中，加入当天配制好并预热的SFM/BSA液5mL(注意两者之间温差一定要小于1℃)。室温放置5min。

(2)将上述精液转移至装有40ml SFM/BSA的50ml离心管中，25℃，800g离心10min小心吸去上清，加40ml SFM/BSA(25℃)精子稀释液于17℃800g离心10min小心吸去上清，加入3-4ml SFM/BSA(17℃)轻轻吹打，使精子重悬。