[发明专利]提高细菌基因表达的活化因子

说明书

技术领域：

本发明提供了一种提高细菌基因表达产物的新方法，可用于发酵工业，制备微生物工程及基因工程的产品。本发明可以用应用于提高其它微生物基因表达等领域如环境保护、石油裂解及开采，生物制药及生物添加剂。 

背景技术：

在Comamonas testosteroni染色质DNA中克隆出的一段DNA片段(564bp)编码了一种细菌活化因子蛋白，据资料报道；细菌中存在一种能与RNA聚合酶结合的活化因子蛋白，该活化因子蛋白还能与细菌基因启动子特异性地松散结合。本研究证明了Comamonas testosteroni中的活化因子蛋白能够提高大肠杆菌和Comamonastestosteroni某些基因的表达，从而为该活化因子蛋白的应用提供了一个可行的途径。 

发明内容：

为了提高细菌基因产物的表达，本发明提供如下质粒： 

首先将280bp的tac启动子DNA片段(Rai)克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，在tac启动子下游再插入564bp的活化因子蛋白基因，从而构建成为质粒pKtac-act5。如附图2所示，pKtac-act5含有卡那霉素抗性基因，同时该质粒可在多数革兰氏阴性菌中复制。再不能复制的细菌中该质粒可整合到细菌染色质DNA中使细菌具有卡那霉素抗性标志，从而达到筛选工程菌株的目的。在可复制的细菌中需要在培养基中加入卡那霉素维持质粒的存在，被整合的菌株则可在无抗生素的培养基中长期稳定的保持pKtac-act5的遗传特性。 

上述质粒pKtac-act5提高细菌基因表达的主要特征在于： 

(1)在制药工业中某些工程菌可以产生具有生物活性的药物，但是由于表达量过低，难以进行工业化生产。使用本质粒pKtac-act5可有效的提高工程菌的目的产物的表达水平(5-50倍)，从而解决了分离提取的问题，并能达到药品所规定的纯度标准。 

(2)在自然环境中，有许多的化学农药污染，利用普通的微生物很难达到分解化学农药的目的，使用本质粒可有效的提高微生物分解化学有害物质的能力。 当本质粒整合到细菌染色质DNA中之后，可相当稳定的在卡那霉素的环境中保持50天以上。 

采用了质粒pKtac-act5可有效的提高石油裂解菌群的石蜡液化能力，从而提高石油产量。 

(3)应用本质粒重组的Comamonas testosteroni工程菌具有独特的分解类固醇类化合物和脂肪功能，可以制备降低胆固醇类药物及饲料添加剂. 

具体实施方案：

实施例1： 

用氯化钙方法直接将质粒pKtac-act5转化到pK18可复制的细菌中，在培养基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可维持激活子蛋白的表达，从而提高基因表达产物的水平。 

实施例2： 

用点穿孔方法将质粒pKtac-act5转化到pK18不可复制的细菌中，在培养基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可在平皿中筛选出被质粒pKtac-act5整合(细菌染色质DNA)的克隆。用PCR方法证明整合的正确性之后，该工程菌既可被使用。 

附图说明：

本发明的提高细菌基因表达活化因子的基因序列、限制性内酶切位点及生物学活性结果见附图1-6。 

图1：3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)的活化因子(激活子)基因及氨基酸序列。基因序列显示4个GTG起始密码。在第3，4GTG附近制备的移码突变pKPsS1失去激活子活性，所以只有第1，2GTG是可能起始密码。氨基酸序列显示胰酶类似酶可能的水解位点。 

图2：质粒pKtac-act5(act5)的物理图谱。 

图3：活化因子基因重组3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)后，酶联免疫吸附实验检测活性表达结果。酶联免疫吸附实验结果证明将活化因子基因加到3α-羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3α-HSD)基因的不同方向(P1，P23，P24)都能提高3α-羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3α-HSD)的表达(对照为P6，无活化因子基因)。 

图4：酶联免疫吸附实验结果表明在E.Coli中当活化因子的表达量增高时3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)表达也增高。 

图5：酶联免疫吸附实验结果表明在C.testosteroni菌中转入P^BBtac-act6，3a羟基睾丸酮氧化/脱氢酶(3a-HSD)的表达都提高，对照为空质粒P^BBR1MCS-2和无质粒野生菌。 

图6：活化因子作用机理。