[发明专利]一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法

权利要求书

1.一种快速检测鉴定茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的 青枯病的方法，包括以下操作步骤：

(1)检测病样品的准备：用水冲洗干净待检病样品的茎基部和根部， 从茎基部取一小块大小为1.5～2mm×2.5～3mm的维管束组织；

(2)肉眼观察病样组织在载玻片水滴中表型：吸取80～100μL的灭菌 水，滴在干净的载玻片上，将步骤(1)中维管束组织放入载玻片的水滴中， 并压入水滴中，静置，观察有无雾状菌浓从病样组织中喷出；如有，继续下 一步试验，如无，说明该病样品不是由茄科青枯菌侵染引起的；

(3)PCR进一步检测验证：取步骤(2)的水滴里病样组织喷出的雾状 菌浓作为模板，进行PCR反应；所述上游引物为5′-atgattctgcggcctacgcggcat -3′，所述下游引物为5′-agtcgggtctggcgtcgaccatcaa-3′；

(4)结果鉴别：将步骤(3)所得的反应产物在琼脂糖凝胶上电泳；在 凝胶成像系统中观察，如有517bp大小的特异性条带，即确认病样品是由茄 科青枯菌侵染引起的，如无该特异条带，则该病样品不是茄科青枯菌侵染引 起的。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR反应是从步骤(2)的水 滴里的病样组织喷出的雾状菌浓中吸取1μL作为模板，加入到PCR管中， 再分别加入1单位Taq酶、200μmol/L脱氧核糖核苷酸、上游引物及下游引 物各0.5μmol/L、1倍PCR反应缓冲液，用双蒸水补足至总体积为25μL， 于PCR仪中进行PCR反应。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR反应条件为94℃预变性4min， 94℃变性1min、52℃退火45s、72℃延伸50s，30个循环，最终延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步骤(4)中反应产物是在质量体积百分比为0.8～ 1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，50～75V恒压电泳50～70min。

5.根据权利要求1所述的一种快速检测鉴定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，所述待检病样品为茄科青枯菌侵染引起的茄子、 番茄、花生、马铃薯、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、菊花或桑树的病样组织。