[发明专利]甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。 

背景技术

流行性感冒(influenza)简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，此病传染性强，传播迅速，抗原易变异，尤其是甲型流感病毒，其进化频率高于乙型和丙型流感病毒，曾经三次导致世界性流感病毒大流行，如1918年的H1N1(猪型)，1957年的H2N2型(亚洲型)和1968年的H3N2型(香港型)。目前，墨西哥、美国爆发的甲型流感病例属于H1N1亚型，引起这次疫情的H1N1亚型流感病毒为流感病毒新变异型--2009年北美变异株，可同时感染人和猪。 

在自然界中，甲型流感病毒的宿主范围相当广，猪、马、水貂、海豹、鲸、禽类以及人类中都已经分离出甲型流感病毒。但是甲型流感病毒在不同宿主中的亚型分布不同，所有的HA、NA亚型均能从禽类中找到，水禽是其天然储存库；而在哺乳动物中仅发现了有限的亚型，已知的只有三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(N1和N2)，其中H1N1和H3N2型是感染人类并能够引起一定范围流行的甲型流感病毒。 

研究发现猪在流感传播过程中承担了流感病毒基因重组发生混合器的角色，同时猪也能感染禽流感和人流感。禽H1N1和人H3N2可传播给猪，猪H1N1可传播给人，人流感病毒可传播给鸭，并在鸭体内储存。1918年引起世界性流行的猪型流感病毒H1N1就可能来自禽流感病毒；实验感染也发现，禽、人流感病毒在猪体内都可有效繁殖，种系及流行病学分析也表明，禽、人流感病毒可通过自然途径传播给猪，并在猪体内重组后传播给人。 

最早报导的从猪体内分离出类似甲/Hong Kong/68的流感病毒是在1969年，而后在世界各地连续不断地从猪群中分离到H3N2病毒株。一些间接的血 清学证据也表明，人类H3N2型流感病毒的变异株可以感染猪。1976年1月，在美国新泽西州发生了甲1型(猪型)流感。从1名死于肺炎的士兵体内分离到此型病毒。通过流行病学调查，多数患者与猪有密切的接触史。 

综上所述，甲型流感病毒H1N1亚型2009年北美变异株、类人型H1N1和古典型猪H1N1、H3N2均应是我国口岸检验检疫关注的重点检疫目标，在高度重视H1N1亚型2009年北美变异株的同时，也要注重类人型H1N1和古典型猪H1N1、H3N2的防控工作。为更好、更彻底地从根本上防控甲型流感疫情，严格出入境检验检疫，防范甲型流感跨境传播，确保人民群众身体健康和生命安全，很有必要迅速建立起特异性强、敏感性高、适合国境口岸快速验放的甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒的快速检测方法。 

实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)将普通RT-PCR技术与荧光检测相结合，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，整个检测过程只打开一次试管，有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。 

文献检索表明，目前国内外诊断甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒的方法仍然是病毒分离、血清学诊断反应和普通RT-PCR、荧光RT-PCR等，一次试验完成甲型流感病毒初筛及H1N1、H3N2亚型流感初步确认的荧光RT-PCR检测技术尚属空白。经典的病毒分离、血清学诊断方法费时费力，不适于临床检测，不符合生物安全条例的要求，无法满足国境口岸快速验放的要求。普通PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测扩增反应后需要电泳检测，这不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。单重荧光RT-PCR，仅能对流感进行通用型检测，不能确诊定型。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明采用的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点，一次试验即可完成甲型流感病毒初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒初步确认。 

本发明所采用的技术方案是：本发明中甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法，包括以下步骤： 

(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感 

病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针， 

具体的核苷酸序列如下： 

A型流感病毒：P1 5’-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3’