[发明专利]EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体，特别是涉及一种 筛选和优化组合EBV-DNA酶肽抗原，验证优选的酶肽抗原检测EBV-DNA酶IgA的特 异性和灵敏度，并建立EBV-DNA酶肽抗原ELISA技术检测血清或血浆中EBV-DNA 酶IgA抗体的方法，应用于鼻咽癌的筛查和辅助诊断。

背景技术

鼻咽癌(NPC)是发生于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，最常见于中国南方(如广东、 广西、湖南、福建等省)和东南亚的一些国家，全世界80％以上的鼻咽癌发生在中国南 方。早期诊断是提升癌症治愈率的关键，但由于早期临床症状不明显，且缺乏好的早期 诊断指标和筛查技术，一般确诊时鼻咽癌都为晚期。

鼻咽癌的早期诊断对患者的治疗效果、预后判断极为重要。多年来，人们对NPC的 早期诊断方法进行了大量研究。血清EA-IgA、VCA-IgA检测因其易行已成为目前常用 的血清学诊断方法，但存在一定程度的假阳性和假阴性。大量报道EBV-DNA酶的出现 提示EBV处于病毒的增殖周期，其在受染机体内的含量高低直接反映病毒复制的活跃程 度，鼻咽癌血清样本中含有高滴度的EBV-DNase抗体，EBV-DNA酶可用于鼻咽癌的 早期诊断。目前，检测EBV-DNase抗体主要是同位素中和法，此法操作繁琐，且有同 位素污染，不易推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体， 应用本发明作为鼻咽癌筛查手段，早期发现鼻咽癌，早期治疗，有助于鼻咽癌的愈后。

本发明公开了一种以EB病毒DNA酶(EBV-DNase)蛋白的优选肽抗原作为包被 抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体的技术。该优选的EBV-DNA酶肽抗原包含 的氨基酸序列是：EBV-Dnase-7(序列ATCTLGSDLL LDASVEIPVA)和EBV-Dnase-8 (序列VLVTPVCLPD SIVRKELNTA)。该EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最佳包被 浓度为200ng∶100ng混合包板。

本发明还提供了一种ELISA法检测血清或血浆中EBV-DNA酶IgA抗体方法是用 优选的以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8为序列合成的混合肽抗原建立的，该检测方法 包括以下步骤：

1)包被：用0.05M PH9.6的碳酸盐包被缓冲液将多肽稀释至蛋白质含量为1～10μg /ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜；

2)封闭：次日，弃去孔内溶液，再每孔加入3％BSA[BSA粉剂为SIGMA，溶于 0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)中，]200μl，37℃，孵育1小时；

3)洗涤：

①手工：倒掉反应孔中的液体，用稀释后的清洗液(配方见表2所示)洗4次，每次 每孔300ul；或者是

②洗板机：程序设定为稀释后的清洗液洗4次，每次每孔300ul；

4)加样：将标准品、阳性对照、阴性对照以及按1∶100与样本稀释液稀释之后的 待检样品加入反应孔中，并做空白对照(即加100ul样本稀释液稀释)，100ul/孔，置 37℃，孵育1小时；

5)洗涤：同上；

6)加酶标抗体：于各反应孔中，加入酶标抗体，100ul/孔，置37℃，孵育1小时；

7)再次清洗：清洗6次，方法同上；

8)加底物液显色：于各反应孔中加入底物A(含过氧化氢)溶液50ul，底物B(含TMB) 溶液50ul，轻摇混匀，置于阴暗处，15分钟；

底物A为体积百分比浓度为0.6％过氧化氢溶液，

底物B配方以10mg TMB(四甲基联苯胺)溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)中 作为原液，并按照如下方式配制

上述原液                           1ml

0.1Mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液    57.5ml

0.2mol/L枸橼酸缓冲液               42.5ml

9)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，轻摇混匀，置5分钟；