[发明专利]石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法与应用。

背景技术

垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，简称PACAP)，是下丘脑分泌的38个氨基酸的肽类物质。自1989年被发现以来，随着对其越来越深入的研究，表明PACAP作为一个神经肽类激素，对中枢神经系统和周围神经系统都有着重要的调控作用。由于其广泛的生物活性和生理活性所以对脊椎动物的生长、发育、繁殖都有重要作用。

石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属科(Serranidae)石斑鱼属(Epinephelus))，有30多种，石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂，因此，迫切需要提供一种可以有效促进石斑鱼苗种生长的饵料添加剂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种经人工改造的，有利于在酵母中高效表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因；

本发明另一目的在于提供含有上述酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的表达载体；

本发明另一目的是提供上述表达载体转化的重组工程菌株；

本发明另一目的是提供上述重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的生产方法；

本发明还有一个目的是提供上述石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽在制备海水鱼类使用的生长和繁殖调控剂中的应用。

本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

本发明酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因，如SEQ IDNO：1所示，该基因序列是通过引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5经PCR扩增得到的。

本发明构建了含有石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽基因序列的表达载体，该载体的构建方法如下：将通过引物搭桥PCR方法合成的斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即ECORI和NOTI)之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的表达载体。

其中，上述表达载体优选毕赤酵母表达载体pPICZαA，将斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因经酶切和分离纯化后，接入到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，得到含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体pPICZαA-PACAP。

通过上述含有石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体构建了能高效表达石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的重组毕赤酵母工程菌株。

其中，上述重组毕赤酵母工程菌株优选含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体pPICZαA-PACAP转化毕赤酵母X-33而得到的菌株pPICZαA-PACAP-X-33。

利用上述重组毕赤酵母工程菌株生产斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的方法，包括如下步骤：

(1)菌种的培养发酵：将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中培养；

(2)菌种的诱导表达：将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中培养，加入甲醇进行诱导后收集上清，得到表达产物；

(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽。

上述方法优选为如下步骤：

(1)菌种的培养发酵：将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中，30℃培养过夜；

(2)菌种的诱导表达：将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中，30℃培养，每隔24小时加入0.5％的甲醇进行诱导，36小时后收集上清，得到表达产物；

(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽。

上述重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽可以直接用于制备适合海水鱼尤其是石斑鱼属使用的生长和繁殖调控剂，也可以通过适当的赋形剂、保护剂按一定比例形成组合物来应用。