[发明专利]副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制备及其免疫保护功能的应用

说明书

技术领域

本发明涉及副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制备方法及其免疫保护功能的应用。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水中常见的弧菌之一，是近年来引发微生物性食物中毒居首位的病原菌，也是水产养殖中的一种重要致病菌。对这类致病菌的防治主要包括药物即抗生素防治以及免疫防治。抗生素虽然在最初的使用中取得了巨大的进展，然而随着抗生素的广泛使用，也出现了一系列的相关问题，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐药菌的产生，细菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐药性而人为地加大剂量，加剧耐药性的产生。因此，研制以具有免疫保护作用的高效中和抗原为成分的疫苗具有广阔的应用前景。

在各种动物疾病的防治中，疫苗的使用是一个低成本、高效的方法，并且已经有部分疫苗得到大规模使用并取得了不错的防治效果。疫苗种类很多，以细菌为例，包括全菌疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫菌等。从实际应用的情况来看，全菌疫苗虽然具有制作相对简单而且成本也较低的优点，但也存在不少由于使用全菌体而固有的一些缺点，如减毒全菌疫苗可能出现菌株突变而导致毒性恢复等不良后果；灭活全菌疫苗则往往由于对细菌进行灭活而导致一些免疫保护基团活性改变，影响免疫保护的效果。而且对全菌疫苗来说，由于细菌成分的复杂性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，会导致机体产生不良反应。常规制得的全菌疫苗免疫保护效果并不理想，然而，全菌疫苗仍然是目前最为主要的疫苗种类，其原因可能与高效中和抗原的发现和鉴定困难有关。

基因组学、蛋白质组学和转录分布图技术的发展，为细菌疫苗提供了新的契机。基因工程疫苗由于其高效而且摆脱了传统疫苗的种种缺点，成为疫苗研究的重点，具有广阔的应用与开发前景。外膜蛋白(outer membrane protein，OM protein)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进行黏附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主识别作为攻击目标，使得革兰氏阴性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液免疫，而且对细胞免疫亦有刺激作用。近年来，细菌的一些外膜蛋白已经被证实具有良好的免疫原性，对细胞免疫和体液免疫均有刺激作用，用其制备基因工程疫苗具有良好的前景，例如在大肠杆菌中发现外膜蛋白OmpX的免疫保护功能。然而，副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的免疫保护功能及其应用尚未被报道。

发明内容

本发明提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的制备方法，包括以下步骤：

1)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的扩增；

2)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的克隆、筛选；

3)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061基因的表达；

4)副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的纯化。

本发明还提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061作为疫苗组分的应用。其中，所述的疫苗用于抵抗细菌感染，包括抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞杆菌以及嗜水气单胞菌的感染。

本发明还提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP1061在制备抗细菌感染制剂中的应用。其中，所述的细菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞杆菌和嗜水气单胞菌。

副溶血弧菌外膜蛋白VP1061的被动免疫保护试验、主动免疫保护试验及主动交叉免疫保护试验结果表明：副溶血弧菌外膜蛋白VP1061免疫鲫鱼后可显著提高鲫鱼对致病性副溶血弧菌的抵制力；免疫鲫鱼和小鼠后还可以提高鲫鱼和小鼠对溶藻弧菌、荧光假单胞杆菌和嗜水气单胞菌的抵抗力。由此可见，副溶血弧菌外膜蛋白VP1061具有明显的免疫保护作用，可用作疫苗组分或者抗细菌感染制剂，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞杆菌和嗜水气单胞菌感染所导致的疾病。

附图说明

图1为VP1061基因PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准；

图2为VP1192基因PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准；

图3为重组PV1061基因和重组PV1192基因双酶切鉴定图，其中1为VP1061，2为VP1192，M为DNA分子量标准；

图4为VP1061基因表达与纯化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图，其中1为VP1061，2为VP1192，a为基因表达产物，b为纯化产物。

具体实施方式