[发明专利]一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法

权利要求书

1.一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法，其特征在于采用 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpd 驱动GenBank登录号为AF249880的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化 酶基因在灵芝中过量表达，提高灵芝生物产量、胞内和胞外多糖含量。

2.根据权利要求1所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 是将从水稻中克隆的与多糖代谢相关的关键酶基因OsUgp2与构巢曲 霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子连接，构建过量表达载体 OsU-gpd；选择标记基因为潮霉素抗性基因，采用农杆菌介导法将表 达载体OsU-gpd转入灵芝，得到具有潮霉素抗性的转化菌株，提高 灵芝生物产量、胞内和胞外多糖含量。

3.根据权利要求1所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 包括以下步骤：

(1)以含gpd启动子的pAN7-1质粒为模板，设计引物扩增gpd 启动子片段获得PCR扩增产物，连接农杆菌介导转化水稻的表达载体 OsU-ubi，并使OsU-ubi原有的ubi启动子被gpd启动子所取代，构 建灵芝过量表达载体OsU-gpd，将表达载体OsU-gpd导入农杆菌 LBA4404；

(2)将步骤(1)导入了表达载体的农杆菌LBA4404活化后介 导转化灵芝菌丝体，筛选转基因灵芝菌株；

(3)转基因灵芝的PCR鉴定和Southern鉴定，测定多糖含量和 生物量。

4.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 步骤(1)所述引物序列为：

P-F：5’-AGCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTAC；

P-R 1：5’-CTCACTAGTGTTCTTGGATGGGAAGATG。

5.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 步骤(2)所述农杆菌活化至OD值为0.6～0.8。

6.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 步骤(2)所述灵芝菌丝体转化是取灵芝菌丝体与活化好的农杆菌混 匀，涂布在CYM固体培养基上，于培养箱中28℃黑暗共培养2天后， 在平板上倒入筛选培养基于28℃继续培养3天，肉眼可见白色的再 生菌落后继续培养5天，将新长出的转化菌株转接到筛选培养基上筛 选；

所述筛选培养基为CYM固体培养基+潮霉素(Hyg)20μg/mL+ 头孢唑林钠(Cefo)500μg/mL。

7.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于 步骤(2)所述筛选是将新长出的转化菌株转接到筛选培养基上筛选， 每天转接一次，转接2～3次至没有农杆菌的生长，得到的转化菌株 在不含潮霉素抗生素的MYG培养基上继代培养5代后，再在含潮霉素 抗生素20μg/mL的MYG培养基上培养，筛选得到潮霉素抗性的灵芝 转化菌株；

所述筛选培养基为含潮霉素20μg/mL和头孢唑林钠500μg/mL 的CYM固体培养基；所述MYG培养基含10g/L麦芽糖，4g/L葡萄糖， 4g/L酵母提取物，1g/L胰蛋白胨，15g/L琼脂条。