[发明专利]抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及抗微管类化疗药物疗效相关的基因mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法。

背景技术

抗微管类化疗药物是一类重要的化疗药物，主要包括有紫杉醇、泰素帝、长春碱和长春新碱和诺维本。其中，紫杉醇通过促进微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促进微管双聚体形成、阻止其多聚化，导致纺锤体异常并抑制有丝分裂而使细胞阻滞于G-2/M期，进而诱导细胞凋亡。而长春类生物碱能在受体部位与纺锤微小管蛋白结合，形成高度规则的结晶体，从而影响微管蛋白装配，使细胞阻滞于G-2/M期，阻断细胞的正常分裂。抗微管类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要神经系统毒性、组织局部坏死、脱发、低血压、支气管痉挛、恶心，呕吐或腹泻、红斑等不良反应。

大量的临床研究已经证实，抗微管类药物的疗效/毒副作用与患者体内β-微管蛋白-III(β-tubulin-III，TUBB3)、STMN1的表达水平关系密切。

(1)抗微管药物与β-微管蛋白-III(β-tubulin-III，TUBB3)

细胞内微管蛋白是细胞骨架的重要组成部分，是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位。人类细胞中存在着6种β微管蛋白同型体，其中3型β微管蛋白(β-tubulin-III)与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系。β-tubulin亚型的选择性表达，最主要是β-tubulin-III的过表达可减弱紫杉醇与微管相互作用的动力学，从而导致紫杉醇的耐药性。在细胞系的研究中证明β-tubulin-III的过表达与紫杉醇的耐药性相关，大量临床研究也支持β-tubulin-III过表达与对紫杉醇的低应答存在相关性。在一项对93例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的研究中，发现β-tubulin-III的表达水平是与无进展生存率(P＝0.04)和总生存率(P＝0.012)相关的独立因素，显示高表达的β-tubulin-III与长春瑞滨的耐药性和NSCLC患者的化疗预后不良也有密切关系。因此，β-tubulin-III的表达水平可能是抗微管类化疗药物的良好预后指标。

(2)抗微管类药物与STMN1

STMN1(Stathmin，又称oncoprotein18)，其编码的STMN1蛋白通过促进微管的解聚或阻止微管的聚合从而影响有丝分裂纺锤体的形成。抑制STMN1表达可以干扰恶性肿瘤细胞的有丝分裂，从而影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。在多种肿瘤细胞系的研究和临床研究中，STMN1基因的mRNA表达水平与抗微管类化疗的疗效密切相关。STMN1低表达的肿瘤患者接受长春瑞滨/顺铂治疗的效果较好，中位生存期较长，反之，STMN1高表达的患者接受长春瑞滨/顺铂的疗效较差。而且，STMN1在肿瘤中mRNA的表达水平与患者预后直接相关，STMN1的表达水平越高，患者的生存率越低，肿瘤发生转移的风险越高。

(3)持家基因β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)和TATA框结合蛋白(TBP)

持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。

基于以上基因的表达水平与化疗药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受化疗药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。