[发明专利]一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown，1951)，又称咸水小瓜虫(Ichthyophthirius marinus)，是一种鱼类专性寄生虫，寄生于热带、亚热带海水鱼身体，使宿主发生“白点病”。刺激隐核虫的宿主范围很广泛，除软骨鱼类对刺激隐核虫有较强抵抗力外，海水硬骨鱼类普遍能被刺激隐核虫感染，严重感染会导致鱼类大量死亡。近年来刺激隐核虫病在世界各地频繁爆发，危害日益严重，我国南海海水养殖区也年年爆发“白点病”，造成了很大的经济损失。但目前防治海水鱼类“白点病”的方法很有限，虽然一些物理和化学方法能起到一定效果，但它们都或多或少存在一些缺陷，如对鱼有毒性、效果不确定或者不适用于大水体等等。

Colorni(1985)曾提出鱼类对刺激隐核虫可能会产生获得性免疫保护，此后他进一步提出：由于刺激隐核虫生长于宿主的上皮层内，与宿主有着更密切的关系，合适的疫苗可能成为防治刺激隐核虫的有效方法。但是要对某种鱼采用免疫预防措施，首先就要弄清楚该种鱼是否能对刺激隐核虫的感染产生获得性免疫力，是否能得到足够的免疫保护。Burgess等(1995)首次证明了鲻鱼(Chelon labrosus)可以对刺激隐核虫产生获得性免疫保护，且保护力与感染强度成正比。Yoshinaga等(1997)发现经刺激隐核虫免疫后底鳉(Fundulusheteroclitus)能产生抗血清，该血清能使寄生虫的幼虫纤毛聚积成团并发生阻动(Immobiliazation)。在以卵形鲳鲹作为动物模型进行刺激隐核虫标准化传代过程中也发现，随着被感染次数的增加，卵形鲳鲹的抗感染能力逐渐加强，感染上鱼的寄生虫数量逐渐减少。

鉴于以上实验已经证实了鱼类对刺激隐核虫的感染能产生获得性免疫力，并得到足够的免疫保护，因此研制刺激隐核虫幼虫的灭活疫苗用以防治该寄生虫具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种对鱼没有毒性且免疫效果显著的刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。

本发明另一目的在于提供上述刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的应用。

本发明上述目的通过以下方案予以实现：

一种刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)刺激隐核虫活幼虫的收集；

(2)刺激隐核虫幼虫膜蛋白的提取；

(3)在幼虫膜蛋白中加入PBS作为水相，10号白油、司本-80和硬脂酸铝混合作为油相，按照水相∶油相＝3∶7的体积比进行乳化，得到刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗。

其中，步骤(1)中所述刺激隐核虫活幼虫的收集方法优选为：刺激隐核虫幼虫孵出后，收集虫液，加入10wt％的蔗糖，离心10min，弃上清，收集沉淀中的活幼虫。

步骤(2)中所述刺激隐核虫幼虫膜蛋白的提取是利用非离子去垢剂在0℃时可同时溶解亲水性蛋白质和疏水性蛋白质，而在30℃时只溶解疏水性蛋白质的特点，逐步将疏水性的膜蛋白分离出来：刺激隐核虫幼虫的细胞或纤毛在0℃时溶解于去垢剂中，经离心去掉细胞骨架和纤毛轴丝，将含有去垢剂的上清液加热到30℃，使亲水性蛋白质和疏水性蛋白质组分分别成为水相和去垢剂相，再经过低速离心，把去垢剂相中的膜蛋白分离出来，最后用有机溶剂将膜蛋白沉淀出来。所述非离子去垢剂优选Triton X-114，所述将膜蛋白沉淀出来的有机溶剂优选丙酮。

步骤(3)中，所述油相为白油、司本和硬脂酸铝混合加热至透明，经高压灭菌后处理得到。

所述白油优选为10号白油。

所述司本优选为司本-80。

本发明刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗可用于制备防治海水鱼类的刺激隐核虫病的药物，特别是用于制备防治“白点病”的药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过离心获得刺激隐核虫活幼虫并将其膜蛋白作为免疫抗原制备得到的刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗质量好，对鱼类无毒性，安全性高，用本发明刺激隐核虫幼虫膜蛋白油佐剂疫苗免疫海水鱼类，可以使卵形鲳鲹的死亡率降低90％，使斜带石斑鱼的死亡率降低100％。

附图说明

图1为卵形鲳鲹经致死剂量幼虫(3×10⁴个幼虫/鱼)攻毒后的死亡情况；