[发明专利]一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类以海藻酸钠为骨架、以聚乙烯亚胺为侧链，可生物降解的阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用。 

背景技术

基因治疗是将具有治疗意义的遗传物质转移至人体细胞，表达出所需要的多肽和蛋白质，从而达到治病目的的一种新方法。如何利用载体将外源基因准确有效地导入靶细胞是基因治疗成功的关键技术。基因载体包括病毒和非病毒载体。目前的临床实验研究中80％采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒类载体。病毒载体的优点是转染效率高，缺点是存在免疫原性、毒性、致癌性、宿主DNA插入整合等安全隐患。非病毒载体可克服前者在免疫原性及安全性等方面存在的问题，而且具有物理化学性能可控、重复性好、易于制造、成本较低、装载DNA的能力强，可大规模生产等优点，因此正成为基因载体研究中的一个热点。但非病毒载体的最大问题是转染效率较病毒载体低得多。 

非病毒载体包括阳离子脂质体和可降解阳离子聚合物。阳离子脂质体在体外无血清基因转染中有较高的效率，但有血清时则转染效率极低。在体内应用时，它极易被血清迅速清除，并蓄积在肺组织，诱发强烈的炎症反应，导致高水平的毒性。而阳离子聚合物载体具有优异的DNA结合及保护能力，可方便地对其进行靶向性及生物适用性改性，提高其抗血清能力及基因转染效率、降低细胞毒性等，近年成为重要研究领域。 

为了提高阳离子聚合物的基因转染效率，研究者从基因治疗过程中的两个重要步骤，即基因传输和基因表达着手，设计了各种解决方案：如采用可降解阳离子聚合物，使DNA/聚合物复合物进入细胞后因聚合物的降解而使质粒更容易和载体分离；在阳离子聚合物中引入内涵体破坏性基团或成分，使复合物能从进入细胞后形成的内涵体中逸出；引入靶向基团，使基因靶向传输到特定细胞，进而 增强复合物受体介导的内吞；引入核定位信号因子，使复合物能在细胞液中接近细胞核并将DNA转运至细胞核等来弥补转染效率不足的缺点，这些方法目前都取得了一定的效果，但仍未达到临床使用要求。 

目前用做基因载体的阳离子聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性产物、聚酰胺基胺、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖及其改性产物、带有阳离子侧基的聚烯烃等。其中聚乙烯亚胺PEI具有优良的DNA装载能力，及可促进DNA从内涵体逃逸至细胞质中的“质子海绵”特性，是目前被研究得最多的具有较高转染效率的阳离子聚合物基因载体，但它不可降解，且分子量越大，转染效率越高，细胞毒性也越大。研究证明，当PEI的分子量为25k时具有较高的基因转染效率、较高的细胞毒性；当PEI的分子量＜2k时，基本无细胞毒性，且可通过代谢排出体外，但它的转染效率也低。因此，研究者对PEI进行了各种改性，以期进一步提高其基因转染效率和降低细胞毒性，适应临床的使用要求。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，该阳离子聚合物基因载体具有生物相容性好、可控的降解性能、基因转染效率高、细胞毒性低、安全实用、成本低等优点。 

本发明的目的还在于提供上述具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物的制备方法，该制备方法工艺简单、易于控制。 

本发明的目的还在于提供上述阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。 

本发明提供的一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K。 

本发明提供的阳离子聚合物基因载体的其中一种制备方法，包括以下步骤： 

(1)取多醛基海藻酸钠MASA溶于水中，得溶液1； 

(2)将聚乙烯亚胺PEI溶于水中，用酸液调节pH至6～11，得溶液2； 

(3)搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，滴完后，继续搅拌反应； 

(4)将(3)中反应液在蒸馏水中透析，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI。 

本发明提供的阳离子聚合物基因载体的另一种制备方法，包括以下步骤： 

(1)取多醛基海藻酸钠MASA溶于水中，得溶液1； 

(2)将聚乙烯亚胺PEI溶于水中，用酸液调节pH至6～11，得溶液2； 

(3)搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，滴完后，继续搅拌反应；