[发明专利]一种羊水细胞培养基

说明书

技术领域

本发明一种羊水细胞培养基属于生物化学领域。

背景技术

产前诊断是优生学的重要组成部分，它是建立在遗传咨询基础上通过产前检 测胎儿健康情况，对患有严重遗传病、先天畸形的患儿可以及早采取措施，减少 人群中有害基因积累，以减少患儿出生，提高人口素质，因此具有十分重要的意 义。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材、孕中期羊水和脐带血、孕妇外周 血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法，但孕中期羊水细胞检查仍是最主要的方 法。这是因为与其它方法相比，羊水穿刺检查具有操作安全，妊娠流失率低于自 然流产率以及诊断染色体异常较为可靠的优点。

羊水穿刺检查的主要对象为高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智 分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸型、家族性连 锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。其中，高龄孕妇是主要检查对象，在国内占了 整个检查对象的1/3。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综 合症、平衡易位、倒位以及性染色体异常等染色体方面的疾病。由于羊水中活细 胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意即致失败。即使培养成功，因分裂相少、 形态不佳而达不到分析要求，无法进行进一步研究，使羊水产前诊断的应用到受 限制。因此成功的羊水细胞培养，除需要严格的实验操作技术和经验外，培养基 的组成也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖 道脱落的细胞，其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％)，而活力细胞又以贴 壁型细胞为主。如何能促其在体外培养中贴壁增殖，是成功培养羊水细胞的关键 因素。

传统的羊水培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血 清(胎牛血清)。但这种培养基培养的成功率低，成功率低于30％，而且平均培 养周期长，培养周期需要20天，且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了 缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本 上是在基础培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如Chang HC(Chang HC，Jones OW，Masui H，Human amniotic fluid cells grown in a hormone-supplemented medium：suitability for prenatal diagnosis，Proc. Natl.Acad.Sci.，Vol.79，4795-4799(1982))。在DMEM与F12按1∶1混合 的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子，分别为：转铁蛋白 (transferrin)5mg/L、亚硒酸钠20nMol/L、胰岛素(insulin)10mg/L、 三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.1nMol/L、胰高血糖素(glucagon)1mg/L、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ug/L、氢化可的松(hydrocortisone)1nMol/L、 睾酮(testosterone)1nMol/L、雌二醇(estradiol)1nMol/L、孕酮 (progesterone)1nMol/L。Chang HC把含此10种促生长因子配方的培养基称 为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-1培养基。生 长因子加倍的H-1培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-1在培养基添加较 低含量的胎牛血清的情况下，依然能够显著增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生 长速度，使培养成功率达到99％以上，培养周期缩短到10天左右。

实际培养过程中，我们发现虽然配制的含不同比例胎牛血清的分别在 DMEM/F12、α-MEM、F12等常用的基础培养基基础上添加而成的H-1培养基都可 以成功地培养出羊水细胞，但依然存在着克隆数目较低，克隆增殖较慢，收获的 分裂相细胞仍较少等问题。因此当种植的羊水样品状况不佳时，即活性细胞较少， 克隆数目只有1-2个，无法在短期内生成足够的分裂相细胞，此时需胰酶消化后 传代培养，这无疑延长了细胞培养周期。因此H-1培养基的培养效果与临床检验 单位的需求仍有一定差距，有必要对培养基配方进行改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆 数目和细胞增殖速度，缩短培养周期，获得分裂相染色体数目多的羊水细胞培养 基及其配方。