[发明专利]稳定表达Tet-Off Advanced的人高转移鼻咽癌细胞株S18及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鼻咽癌细胞株及其建立方法和应用。 

背景技术

鼻咽癌是发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤。中国的广东、广西、福建等地多发，男多于女。发病年龄大多为中年人，亦有青少年患病者。鼻咽癌恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移，颈部淋巴结转移约为60.3％～86.1％，其中半数为双侧性转移。颈部淋巴结转移常为鼻咽癌的首发症状(23.9％～75％)，有少数病人鼻咽部检查不能发现原发病灶，而颈部淋巴结转移是唯一的临床表现。 

鼻咽癌细胞株是研究鼻咽癌的发病机制、转移机制和治疗的重要模式生物。目前生命科学的研究已经进入分子基因水平，新发现的与鼻咽癌相关的基因数量成爆炸性趋势发展。然而这些基因的功能我们了解的还很少。为了进一步研究这些基因在鼻咽癌的发生和发展的作用，研究其能否作为一种潜在的基因治疗靶点，研究者急需一种能有效控制这些目的基因表达的鼻咽癌细胞作为研究手段，以实现对这些目的基因表达定时定量的调控。 

在基因工程技术快速发展的今天，已经实现了通过基因诱导表达调控系统准确控制基因定时定量转录和表达。目前比较成熟的诱导表达系统主要有四环素诱导调控系统，蜕皮激素诱导调控系统等。Clontech公司开发了两种四环素基因诱导表达系统，即tet-off和tet-on，前者在不存在四环素的条件下才能实现基因的表达，而后者只有存在四环素的条件下才能实现基因的表达。由于这两种表达诱导系统在诱导表达的精确性和表达强度方面尚存在一定的不足，随 后，Clontech公司进一步针对这两种系统开发出tet-off advanced和tet-onadvanced，加强了诱导表达的精确性和表达强度，消除了可能存在的细胞毒性。以tet-off advanced system为例，其基因表达的调控机制是这样的，tet-offadvanced system中含有pTet-Off Advanced质粒和pTRE-Tight质粒，其中pTet-Off Advanced质粒含有四环素调节蛋白的读码框，可以表达调节蛋白；pTRE-Tight质粒含有操纵序列、最小CMV启动子和多克隆位点(目的基因克隆入该处)。最小CMV启动子一旦被激活，则目的基因得到表达。但正常情况下，最小CMV启动子几乎没有活性。只有当调节蛋白与操纵序列特异性结合后，最小CMV启动子才被激活，从而启动目的基因的表达。由于调节蛋白与操作序列是特异性的可逆结合，因此，在tet-off advanced系统中，在不存在四环素的条件下，调节蛋白特异性的与操纵序列结合，从而激活最小CMV启动子，表现出目的基因的过表达；反之，当四环素存在时，调节蛋白与四环素结合而不能与操纵序列结合，最小启动子未能被激活，目的基因就不会被表达。 

将Tet-Off Advanced系统中的pTet-Off Advanced质粒稳定转染到一种哺乳动物细胞，使其能够有效的表达四环素调节蛋白(tTA-advanced)，这类细胞称为Tet-Off Advanced细胞株。Tet-off Advanced细胞株能稳定表达四环素调节蛋白，且对多西环素(四环素的衍生物)调节敏感。当含有目的基因的反应质粒，例如，pTRE-Tight，被导入这类细胞时，通过对环境中四环素的调控，即可控制目的基因的表达，包括什么时间让目的基因表达，表达的强度要多高，想表达多长时间等。其调控在体外或体内均可实现，体外如在培养基中添加多西环素，体内如在饮水中添加多西环素。多西环素诱导的基因表达抑制和增强具有较好的剂量和时间依赖关系。 

因此，Tet-Off Advanced细胞株是研究细胞分子生物作用强有力工具。但目前，仍未有将tet-off advanced系统应用于鼻咽癌细胞的技术。 

发明内容

本发明的目的是针对鼻咽癌研究领域现有技术的不足，提供一种可以有效而精确地实现基因表达调控的稳定表达Tet-Off Advanced的人高转移鼻咽癌细胞株S18。 

稳定表达Tet-Off Advanced的人高转移鼻咽癌细胞株S18，于2009年10月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC C200959，命名为稳定表达Tet-Off Advanced的人高转移鼻咽癌细胞株S18。 

本发明所提供的鼻咽癌细胞株的生物学特征为：细胞呈多边形，贴壁生长方式，是从人未分化鼻咽癌细胞株CNE-2中分离而来的具有高转移能力的细胞株，并保留其原始的生物学特征。