[发明专利]一种卡马西平高效降解菌的提取方法

说明书

技术领域

本发明属微生物细菌的分离纯化领域，特别是涉及一种卡马西平高效降解菌的提取方法。

背景技术

随着环境分析技术的提高和人们环境意识的增强，药物及个人护理品(Phar maceuticaland Personal Care Products，简称PPCPs)作为一种新兴污染物日益受到人们的关注。药物和个人护理用品即使微量存在仍具有相当程度的生物活性，给环境造成不可预测的影响，并可能通过饮用水和食物等途径对人体健康产生潜在危害。

在常见的PPCPs化合物中，抗生素、消炎药、抗癫痫药物在各类环境介质中的检出频率较高。其中抗癫痫药卡马西平(Carbamazepine，CBZ)(分子结构如图1所示)由于药效显著，常作为治疗癫痫病和神经痛的首选药物被大量使用，然而卡马西平是含氮的芳香杂环化合物，目前传统的污水处理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能够有效去除，使其被频繁检出、且检出浓度相对较高，具有一定的生态毒性，是目前最受关注的PPCPs类污染物之一。有研究者将其作为人为影响水环境的一种指示化合物，来评价PPCPs的污染状况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种卡马西平高效降解菌的提取方法，该方法从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取卡马西平降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对卡马西平的降解率可达75％以上，具有良好的应用前景。

本发明的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，包括：

(1)定向驯化培养

取活性污泥(城市污水处理厂二沉池)按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；

(2)菌株的富集分离和纯化

将驯化2个月后的样品静置30min，取上层水样1mL作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养，确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，即可。

所述步骤(1)中的无机盐培养基为K₂HPO₄4.35g/L，KH₂PO₄1.7g/L，NH₄Cl 2.1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，FeSO₄·7H₂00.01g/L，CaCl₂·2H₂00.03g/L，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0；

所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入卡马西平使其浓度为3、5、10、15、20、22mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30℃，振荡速率160r/min条件下进行驯化培养；

所述步骤(2)中的梯度稀释是指作10^-1～10^-10的梯度稀释；

所述步骤(2)中的固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，其中富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；

所述步骤(2)中的富集培养是指将菌液于接种到富集培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株；

所述的卡马西平高效降解菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下：

TAAAGGGGGGGCAGGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTT

GATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAA

CGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT

CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGC

TCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTG