[发明专利]一种分离、纯化许旺细胞的方法

权利要求书

1.一种分离、纯化许旺细胞的方法，其特征是该方法包括下述步骤：

(1)无菌情况下取神经段，去除神经外膜；

(2)用3～5倍组织量的复合胶原酶NB4和dispase混合消化酶溶液消化神经束10～20分钟，弃溶液；

(3)将步骤(2)得到的神经束，置于37℃温浴的质量体积比0.1～0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA作用5～10分钟，得到去除神经束膜的神经纤维；

(4)将步骤(3)得到的神经纤维置于步骤(2)中所述混合酶溶液中，置于37℃，摇床中振荡30～60分钟，得到细胞混悬液；

(5)以600g离心5～10分钟，弃去上清，用许旺细胞培养液重悬。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中胶原酶NB4的浓度为0.1～0.2％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中酵素酶的浓度为0.05～0.1％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是消化酶的溶剂是DMEM培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是将步骤(4)得到的细胞混悬液用吸管反复吹打3～5分钟后进行步骤(5)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是将所得的许旺细胞培养48～72小时，置于15～20℃环境中3～5分钟，收集细胞混悬液，离心弃上清，用许旺细胞培养液重悬，种植于培养瓶。

7.根据权利要求7所述的方法，其特征是收集细胞混悬液前，先水平轻轻振荡所得细胞。

8.权利要求7所述方法的应用，其特征是将所得的许旺细胞培养48～72小时，置于15～20℃环境中3～5分钟后传代，即可得到大量高纯度的许旺细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是细胞种植于培养瓶的密度为2～4×10⁴细胞/ml。