[发明专利]利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法及其应用。

背景技术

许旺细胞(Schwann cells，SCs)是周围神经系统中重要的一种神经胶质细胞，由Schwann(1939)首先发现，在有髓神经纤维髓鞘化，损伤神经修复中起到重要的作用。也是神经营养因子的重要来源，能够分泌神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、睫状神经生长因子(CNTF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。成年哺乳动物中枢神经损伤的轴突欠缺再生能力，但周围神经损伤后，轴突再生能力较为强大，有学者认为，这种轴突再生能力的差异是因为中枢神经自身的微环境不适宜轴突再生。进一步研究表明，将周围神经移植至中枢神经后，轴突能再生长入周围神经内，而起关键作用的成分正是SCs.说明SCs不仅在周围神经损伤后，促进轴突生长，髓鞘化起到关键的作用，再中枢神经的损伤修复中也有重要的作用。

体外培养许旺细胞的组织来源以坐骨神经和臂丛神经最为常用。3-5天内的新生乳鼠和胚胎鼠来源的神经细小，柔嫩，脆而易断，且剥离外膜困难，束膜更是无法剥离。出生6天后至成年鼠神经来源的施万细胞增殖能力较弱，采用体外体内预变处理比较耗时，且增殖能力仍然不是很理想。出生3～5天的SD乳鼠，取材容易，且许旺细胞增殖能力较强，我们设计采用混合酶分步消化法剥脱神经外膜和束膜，操作简单，剥离彻底，获得原代许旺细胞的纯度就可以达到80％以上。

在体外培养许旺细胞扩增传代的过程中，成纤维细胞污染仍然是主要问题，且当在体外培养48小时后，成纤维细胞的增殖速度明显快于许旺细胞，如果不进行纯化，成纤维细胞将成为主要的细胞挤占许旺细胞的生长空间，影响许旺细胞的增殖。目前纯化施万细胞的方法主要有：差速贴壁法、抗有丝分裂法和免疫溶解法等。差速贴壁法是利用在预铺多聚赖氨酸的培养瓶中，成纤维细胞比施万细胞更易贴壁的特点，来达到纯化的目的，不会损伤施万细胞。抗有丝分裂法用抗有丝分裂剂，如Ara2c，G 2418等杀死增殖迅速的成纤维细胞，但同时也对施万细胞有毒性作用，而且操作过程也比较繁琐。免疫溶解法是通过使用成纤维细胞所特有的抗原抗体，如Thy-1等，结合使用补体，以消除成纤维细胞。但由于补体的非特异性作用可损伤细胞，且该试剂昂贵，不适宜做大量细胞的培养，另外还有免疫磁珠，流式细胞仪分选法等，但是以上方法普遍存在，耗时，费力，步骤繁琐或需要大型设备且纯化效果不理想等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、高效的分离、纯化许旺细胞的方法。尤其涉及一种利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法及其应用。

具体而言，本发明提供了一种利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法，其包括下述步骤：

(1)无菌情况下剥离神经段的神经外膜，切碎神经段并置于DMEM培养基中清洗，离心弃上清；

(2)用3～5倍组织量的质量体积比为0.05～0.3％的消化酶溶液消化神经碎块30～60分钟；所述的消化酶是酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；

(3)将步骤(2)得到的混悬液用吸管反复吹打3～5分钟；

(4)以600g离心5～10分钟，弃上清，得到细胞团块；

(5)用许旺细胞培养液重悬步骤(4)得到的细胞，即可。

上述方法中，所述的神经碎块体积为0.5-1.5mm³。例如，本发明的一个实施例中神经碎块体积平均为1mm³。

上述方法中，步骤(1)的DMEM培养基体积是神经碎块体积的3-7倍。

上述方法中，步骤(2)中消化酶可以使用酵素酶和胶原酶NB4的混合液。混合液中，胶原酶NB4的浓度较好为0.1～0.2％，例如0.1、0.15％、0.18％、0.2％；酵素酶的浓度较好为0.05～0.1％。

上述方法中，步骤(2)中消化酶混合酶的溶液是DMEM培养基。