[发明专利]基于氧消耗速率的维生素B12发酵生产控制工艺

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12方法以及相关的操作控制工艺。

背景技术

维生素B₁₂是一种结构非常复杂的分子，根据与其中心钴离子结合配基基团的不同可形成羟钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和氰钴胺素^[1]。

维生素B₁₂的化学结构如图5所示。

维生素B12是一种生物催化活性物质，是哺乳动物不可缺少的维生素，能够预防和治疗恶性贫血症，维护神经系统的健康，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢^[2]。

现在国内和国外商品化的维生素B₁₂几乎都是通过微生物发酵来生产的。能够合成维生素B₁₂的微生物根据其耗氧情况分为两类：(1)厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)^[3]、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)^[4]和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。(2)好氧菌：比如脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)^[5]，钴胺素根瘤菌^[6](Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。

供氧对微生物的生长和产物形成有着重要的影响。对于耗氧微生物发酵过程中，必须供给适量的无菌空气，菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。不同菌种及不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，发酵液的供氧能力的大小直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。因此研究供氧大小对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(Dissolved Oxygen，简称DO)来表征供氧水平^[7]，通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制DO，但对于某些特殊的高耗氧菌种来说，溶氧可能不能成为有效的控制指标，这就需要寻找另外的能有效表征供氧水平的参数。

目前，维生素B12需求量较大，因此优化生产工艺、提高维生素B12的生产水平成为当务之急。本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，不仅要提高维生素B12的产量，而且尽可能的节约能耗、降低成本，提高生产效率，以满足市场的需求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效的生产维生素B12的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生产维生素B12的发酵方法，它包括步骤：

(a)在适合发酵的条件下，培养维生素B12的生产菌株，并且在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；

(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束；和

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

在另一优选例中，一旦菌体的生长进入生长稳定期，就可视为发酵过程前期结束。

在另一优选例中，在步骤(b)中，氧消耗速度的降低是间歇式降低、连续下降或逐步降低。

在另一优选例中，在步骤(a)中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为35-45mmol·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，在步骤(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围。

在另一优选例中，所述的氧消耗速率按以下公式计算：

式中，F_in为进气流量L/min；V发酵液体积L；C_惰in/C_O2in/C_CO2in：分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率；C_O2out/C_CO2out：分别为排气中氧及二氧化碳的质量分率；