[发明专利]一种获得内皮祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程，尤其涉及获得内皮祖细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是成熟血管内皮细胞的前体细胞，自1997年Asahara等利用CD34等表面标志物经免疫磁珠法从人外周血中成功分离纯化出EPC后，有关EPC的分离、纯化、扩增及其功能和应用的研究越来越受到关注，特别是其在血管再生和心血管疾病中的作用已成为近来研究的热点。

目前内皮祖细胞的来源主要为骨髓、外周血、脐血等。但是其数目较少，扩增较难使对其研究和应用受到限制。目前获得内皮祖细胞的方式主要是骨髓、外周血、脐血经过密度梯度分离，接种于纤维粘连蛋白(fibronectin)铺层的培养皿，再加入含一定浓度的生长因子的特殊培养液如EBM添加血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等培养，或者利用磁珠分选或流式细胞仪分选的方式，利用一些细胞表面粘附分子如CD34、KDR、CD133等进行分选后，获得细胞再利用上述培养液进行培养扩增。近年有些报道利用上述细胞表面粘附分子培养的细胞向造血系分化，Marianna等研究发现由于血小板表面表达的粘附分子能够被单核细胞吞噬假表达于某些不能向内皮细胞分化的单核细胞上，从而使利用这些粘附分子进行分选的细胞不能向内皮细胞分化。

目前纯化和扩增EPC的方法操作过程复杂，细胞得率低，价格较为昂贵，极大地限制了其在研究和临床应用方面的发展。

因此，本领域迫切需要提供一种能获得大量纯化的EPC的高效、简便的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种获得内皮祖细胞的方法。

本发明提供了一种获得内皮祖细胞的方法，所述方法包括步骤：将接种密度8×10⁴-6×10⁵/cm²的骨髓细胞孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。

在另一优选例中，所述接种密度为1-6×10⁵/cm²。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(a)将骨髓细胞(原代；经胰酶消化)和细胞培养液混合，得到骨髓细胞悬浮液；和

(b)将骨髓细胞悬浮液以8×10⁴-6×10⁵/cm²的接种密度进行孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。

在另一优选例中，所述的细胞培养液选自IMDM、或α-MEM。

在另一优选例中，所述的细胞培养液是低糖DMEM，以培养液总体积计，其中的胎牛血清含量为8-12v/v％。

在另一优选例中，所述的骨髓细胞悬浮液是1×10⁶-1×10⁷/ml。

在另一优选例中，所述接种密度为1-6×10⁵/cm²。

在另一优选例中，步骤(b)中孵育2-3周。

据此，本发明提供了一种能获得大量纯化的EPC的高效、简便的方法。

附图说明

图1显示了原代培养骨髓细胞表型(Day 6)；其中

A是相差光镜；B是Dil-Ac-LDL染色；C是DAPI核衬染；D是荧光复合。

图2显示了不同接种密度的骨髓贴壁细胞培养情况；其中

A是6×10⁵/cm²接种培养第0天；B是6×10⁵/cm²接种培养第7天；C是5×10³/cm²接种培养第0天；D是5×10³/cm²接种培养第7天。

图3显示了不同接种密度的骨髓贴壁细胞培养7天的情况；其中