[发明专利]一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种具有抗氧化功能的基因、其编码蛋白及其应 用。

背景技术

盐藻(Dunaliella)(又称杜氏盐藻)是一种生存于极端环境下的真核单细胞绿藻，对环 境具有极强的适应能力，是已知最耐盐的真核生物：能耐受高盐、重金属、强烈紫外线辐射 等环境胁迫。因此，盐藻成为了一个重要的抗逆基因资源宝库。

世界人口日益增长，耕地面积日趋减少，提高农作物产量成为了解决这对矛盾的重要途 径。然而，干旱、土壤盐渍化、极端温度和营养贫瘠等各种环境胁迫严重影响了农作物的生 长和发育并降低其产量。所幸的是，开发抗逆基因、运用基因工程手段来提高作物对这些非 生物胁迫的抗性、改良作物对环境的适应能力已经成为了提高农作物产量的有效途径之一。 氧化胁迫正是上述各种初级环境胁迫的次级胁迫，其典型的特征是生物体内会积累高浓度的 活性氧化物(ROS)。ROS是由氧形成的几种活性物质的总称，主要是超氧阴离子自由基、羟 基自由基、过氧化氢单线态氧4种。高浓度的ROS能与蛋白质、核酸和脂类发生作用而引起 蛋白质失活和降解、DNA链断裂和膜脂过氧化等现象，从而导致细胞结构和功能的破坏，严 重影响到农作物正常的生理功能。因此，提高植物抗逆性的一个全新思路就是开发抗氧化基 因，清除植物体内多余的ROS，提高植物对氧化胁迫的耐受性。

高等植物中被广泛研究的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏 血酸专一性过氧化物酶(AP)、谷胱甘肽还原酶(GR)。Peroxiredoxin是近年来新发现的一 类过氧化物酶，它在清除ROS中具有重要的作用。Peroxiredoxin是一类抗氧化蛋白超家族， 广泛分布于原核生物和真核生物中。最初在酵母中发现了第一个该家族蛋白，被命名为巯基 特异性抗氧化酶。该家族所有蛋白均在N端具有保守的Cys残基，有的成员在C端还具有保 守的Cys。根据其保守Cys数目的不同，可以分为4个亚类：2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx (也叫PrxII)、1-Cys Prx和PrxQ。

Preoxiredoxin家族基因广泛地参与了一些重要的生命活动：最重要的生物学功能是将过 氧化物或者超氧化物、烷基过氧化物、过氧亚硝酸盐分别还原成水、对应的醇和亚硝酸盐， 其作用方式是分子内的活性Cys被过氧化氢氧化成次磺酸，再由硫氧还原蛋白为供氢体将还 原型辅酶II的质子转移至Peroxiredoxin使其恢复原来的结构和功能；此外，Preoxiredoxin 还参与了细胞的增殖和分化；保护自由敏感蛋白；通过调节细胞内过氧化氢的浓度来参与细 胞因子信号及联放大等。EST数据表明，盐藻体内存在一套复杂的抗氧化基因，构成了庞大 的抗氧化系统，这些抗氧化基因的功能可能与盐藻显著的抗逆能力有着密切的联系。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有抗氧化功能的基因，该基因是从盐藻(Dunaliella viridis)中分离出来的过氧化物还原蛋白五基因，称为Dv2CysPrx。

本发明的目的之二在于该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。

本发明的目的之四在于提供一种载体，该载体含有本发明的基因。

本发明的目的之五在于提供一种含有本发明基因的宿主细胞。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抗氧化功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列；

一种上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；

一种克隆上述的基因的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

a)将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体Δyap1，在0.2mM过氧化氢叔丁醇 的筛选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆；

b)将步骤a)得到的候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆菌 进行扩增；把扩增以后的载体回转酵母突变体Δyap1，得到在0.2mM过氧化氢叔丁醇 处理下仍能够稳定生长的阳性克隆；

c)利用限制性内切酶EcoRI/XhoI消化步骤b)得到的阳性克隆释放出插入片段，构建到 测序载体中，通过测序获得Dv2CysPrx基因的cDNA序列；

一种重组载体，该重组载体含有上述的基因。