[发明专利]寡肽反相色谱固定相及其制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及液相色谱固定相技术，具体的说，是一种使用“链接化学” (click chemistry)作为键合方法键合寡肽反相色谱固定相的制备方法。

【技术背景】

反相高效液相色谱(英文简称RP-HPLC)是目前使用最为广泛的高效分离 技术，但是，目前反相色谱中最常使用的疏水固定相，如C18，C8等主要是 长链烷烃，导致固定相与被分离组分之间作用力过于单一(主要是疏水性相 互作用)，使得对于复杂组分(如在蛋白组学、代谢组学、制药工业、天然产 物等领域)的分离面临着巨大的挑战。反相/反相二维色谱是复杂组分分离的 一种重要手段，由不同的反相固定相构建的二维色谱，如氰基柱/C18、聚乙 二醇/C18、二氧化锆/C18已有文献报道。但是，目前可与C18固定相结合用 于二维色谱分离的新型反相固定相依然十分匮乏。因此，发展新型反相固定 相在方法学研究和实际应用中都具有重大的意义。

“链接化学”、或为“点击化学”(click chemistry)是由贝瑞·夏普 利斯(K.Barry Sharpless)等提出的，其核心是用少量简单可靠和高选择 性的化学转变来获得更广泛的分子多样性，它开创了快速、有效、甚至是100 ％可靠的、高选择性地制造各类新化合物的合成化学新领域。其中，最为广 泛应用的反应是Huisgen 1，3-diploar cycloaddition反应，它在色谱固定 相的合成上发挥了很重要的作用，其反应式如下：

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种新型的寡肽反相色谱固定相及其制备方法， 以满足在对复杂组分分离的要求，并可与传统的长链烷烃固定相(C18)联用， 构建二维色谱。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种寡肽反相色谱固定相，其结构为：

其中，R是由疏水性氨基酸合成的寡肽。

所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯 丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。

一种寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征是，使用“链接化学”作 为键合方法键合寡肽分子，包括以下步骤：

(1)硅胶表面引入炔基

①在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂、丙炔胺的摩尔 比为1～5∶1.2～5，于60～150℃条件下反应6～36小时；

②然后加入活化的微球型硅胶，每克微球型硅胶所需的硅烷偶联剂为 1～10mmol；

③在80～120℃条件下继续反应12～48小时后，用砂芯漏斗过滤，依次 用二氯甲烷、甲醇、丙酮洗涤，得到固体物；

④将步骤(1)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～120℃条件下干燥 6～12小时，即得末端炔基硅胶；

(2)用“链接化学”键合寡肽反相色谱固定相

①将步骤(1)制备的炔基硅胶加入体积比为1/1～10/1的乙腈/甲醇 或二甲基亚砜/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶所需混合溶剂量为20～50mL；

②再加入修饰有叠氮基团的寡肽及催化剂，修饰有叠氮基团的寡肽加入 的摩尔剂量为硅胶上炔基的摩尔剂量的1～15倍，催化剂为一价铜，所用摩 尔剂量为叠氮寡肽摩尔剂量的1～10％；

③在10～80℃条件下反应72～200小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用甲 醇、重量浓度为2～20％的EDTA二钠水溶液、水、甲醇、丙酮洗涤，得到固 体物；

④将步骤(2)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～80℃条件下干燥 6～12小时，即得寡肽反相色谱固定相。

上述步骤(1)①采用的有机溶剂为N，N--二甲基甲酰胺，每克硅胶所 需有机溶剂的量为5～30mL。

上述步骤(1)①采用的硅烷偶联剂的结构为：

其反应式为：

上述步骤(1)②采用的微球型硅胶是为粒径和孔径均匀的全多孔硅胶 球状体，其粒径为5～40μm，孔径为60～300

上述步骤(2)采用的修饰有叠氮基团的寡肽是由疏水性氨基酸合成的。

所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯 丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。