[发明专利]一种基因修饰及调控的内皮祖细胞捕获支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种基因修饰及调控的内皮祖细胞捕获支架的制备方法，属于生物技术 领域。

背景技术

冠心病是危害人类健康最常见、最严重的疾病之一，经皮冠状动脉内成形术(PTCA) 和支架植入术已成为冠心病介入治疗的主要手段，然而即便是药物洗脱支架仍不能根本 解决术后再狭窄的难题。目前的药物洗脱支架均是通过药物的释放来抑制局部血管的内 膜增殖，但同时抑制了血管损伤后的生理愈合进程，减缓了内皮的修复，而内皮的快速 愈合是抑制内膜平滑肌细胞增殖的关键。重新审视再狭窄的发生机制，恰恰是目前的治 疗手段造成了不同程度的内皮损伤——药物支架抗再狭窄是以内皮损伤或修复延迟为代 价的。本研究通过对内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)的分化特点 的研究，探讨其向内皮分化的调控机制以及EPCs捕捉支架的功能化研究，最终通过基 因调控手段使EPCs捕捉支架的功能得到优化，最大限度的抑制再狭窄的发生。其意义 在于基因水平阐明EPCs的分化机制，并通过基因水平调控其内皮化，寻求抑制平滑肌 细胞增殖和加速内皮修复的平衡点，探索具有我国自主知识产权并优越于已有药物支架 的生物工程化支架。

全球每年实施2百多万例冠脉血管成形术，临床再狭窄病例将超过25万例，其中一 半是复发的再狭窄，防治再狭窄是提高疗效的关键。2002年国际上开始应用紫杉醇、雷帕 霉素洗脱支架防治再狭窄，疗效显著，但仍然存在5～10％的再狭窄率，且出现内皮覆盖延 迟，亚急性血栓形成等并发症，2005年出现的EPCs捕捉支架，旨在通过在支架上固定 EPCs特异性抗体来吸附循环中EPCs，并通过其进一步分化为内皮细胞而促进支架的内皮 愈合从而防止因内皮愈合延迟而导致的支架内血栓。其功效在动物实验和临床试验中均 发现具有一定的促进内皮愈合的作用，但同时有研究报道：该类支架在快速吸附EPCs同 时也会非特异性的吸附大量炎症细胞，同时体内的EPCs亦有部分具有平滑肌前体细胞的 特性，故这些细胞都可能在支架吸附后向平滑肌细胞分化，从而加重再狭窄，部分研究的 结果也证实目前商用的EPCs捕获支架的再狭窄率高于药物支架甚至也不能完全避免血栓 形成的风险。而目前抑制再狭窄通常利用药物如雷帕霉素、紫杉醇等其他细胞“毒性”药 物，均有非特异性杀伤细胞作用从而也抑制内皮细胞的增殖导致内皮修复延迟。本发明旨 在用EPCs捕获支架的基础上，尽可能少用具有“毒性”的抗增殖药物，而是加用平滑肌 细胞分化的特异启动子靶向调控平滑肌细胞的分化和增殖，该基因修饰和调控使捕获支 架在吸附更特异的EPCs基础上，靶向阻断其向平滑肌细胞分化潜能，从而减少再狭窄的 发生，同时保持内皮细胞的正常分化和增殖，进一步提高EPCs捕获支架的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因修饰及调控的内皮祖细胞捕获支架的制备方法，通过基 因调控提高支架抗再狭窄的效率并保存其促进内皮修复的功能。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种基因修饰及调控的内皮祖细胞捕获 支架的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将血管内支架在1wt％氨基硅烷偶联剂乙醇溶液中以频率53kHz超声处理2小 时，依次用0.1wt％稀盐酸和蒸馏水冲洗后烘干；将316L不锈钢支架、镁合金支架或钴镍 金属支架置于0.1wt％壳聚糖的0.2wt％盐酸水溶液中浸泡5分钟后取出，用蒸馏水反复冲 洗；再置于0.1wt％肝素水溶液中浸泡5分钟后取出，用去离子水冲洗，重复3-10次，在 60℃烘干；

第二步：在4℃冰箱内将第一步处理后的血管内支架浸入50-100ug/ml CD34或CD133 抗体溶液中12小时后，用蒸馏水浸泡洗涤1min，重复洗涤3次，自然晾干后，得到内皮 祖细胞抗体支架，于4℃冰箱保存待用；

第三步：通过提取人类基因组后进行PCR扩增得到含有5’端AseI酶切位点和3’端 NheI酶切位点的平滑肌细胞分化的特异启动子基因片段；通过酶切及酶接反应将pEGFPC2 或pcDNA3.1中的原有启动子CMV切除，并在原位酶接上述平滑肌细胞分化的特异启动子 基因片段的5’端；通过提取人类基因组后进行PCR扩增得到含有5’端NheI酶切位点的 Caspase基因，通过酶切及酶接反应将上述平滑肌细胞分化的特异启动子基因片段的3’ 端与Caspase基因结合得到融合基因；