[发明专利]雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种随机突变方法及其在单克隆抗体分子进化技术中的应用。

背景技术

(一)治疗性单抗

自1986年第一个治疗性单抗药物诞生以来，治疗性单抗的产业化已经获得巨大的成功，这可以从以下几个方面的数据得到阐明。

产品数量在急剧增加。在美国，已有近30个治疗性单抗类被批准上市，已经进入临床研究的，目前进入临床研究的单抗共有123件，其中23件已进入III期临床或新药申报阶段；新的进入临床研究的治疗性单抗药物还在快速增加。正在开发的产品有700多个，其中240多个在不同国家进入临床。单抗类药物已经占据正在研发的基因工程药物的30％以上。市场规模在迅速扩大。从市场情况来看，根据过去二十年的情况来看，治疗性单抗药物每年的实际销售增长都明显超出了预期。据DataMonitor 2008年的数据，早在2003年，治疗性单抗已经形成了72亿美元的销售。2006年的销售达到195亿美元，2007年为263亿美元，预计2008年的销售规模将达到350亿美元以上，年增长率高达22.88％。至今已出现12个重磅炸弹级的产品。其中，Enbrel、Humira、Rituxan等6个产品年销售超过了45亿美元。DataMonitor预计，2013年，治疗性单抗市场容量超过500亿美元，并会新出现10到12个重磅炸弹级的单抗药物，使单抗药物达到一个新的高峰。由此可见，无论是从产品研发趋势或是从市场角度，治疗性单抗都保持了高强度的超预期增长，并且这种趋势仍将持续。预计，2008-2010年上市的产品中还有若干会有过5亿美元的销售。

临床指征已全面覆盖。从临床指征上看，在早期，治疗性单抗主要针对各种恶性肿瘤和自身免疫疾病。经过二十几年的发展，单抗类药物的临床指征已经覆盖了各种恶性肿瘤、自身免疫、心血管疾病、感染性疾病等各种重要疾病，其疗效突出，副作用小的特点使其占据了不可取代的地位。特别是在恶性肿瘤和疑难杂症的治疗方面，单抗药物显示了前所未有的光明前景，已经开创了基因工程药物研究的新时代。

特别值得指出的是，近几年单抗药物在治疗老年性疾病，例如帕金森病和阿兹海默症方面也获得突破性进展，引起了业内极大的关注。

至今，在国内已经上市或进入临床的品种多为进口(13种)或仿制品(15种)，国内机构创新的只有7种(上市4种，在临床3种)，均属落后的鼠源或嵌合单抗，缺乏竞争力。至今没有出现国内原创的重量级产品(上海技术预见报告-生物技术研究报告，2008年6月)。由于知识产权意识的不断加强，仿制已无出路，开发有自主知识产权的创新型单抗药物是必然趋势(上海预见报告)。

(二)、获得候选单抗的方法

当前，国际上主要有4种创新型单抗的研发平台，即①鼠源或以鼠源为基础的改造(嵌合和人源化)、②以CAT为代表的全人抗体库技术、③人源化小鼠和④单抗分子进化技术。第①种已经落后，第②种成功率太低，第③种过于复杂、投入巨大、前期工作耗时长且费用高、风险高。第④种是近几年逐渐成熟的技术，国外已有若干成功案例，如AME(CDR-grafting，US patent 7175996)、Morphosys(TRIM technology，文献23，US Patent 7432364)，Crucell()等。它以人工突变和噬菌体高通量筛选技术为核心，使现有单抗的技术指标得以提高。这种技术操作简单、成功率高、风险小且成本低，成为今后创新型tMab开发的核心技术之一。

(三)、单抗库、单抗分子进化技术

单抗分子人工进化技术主要包括原型单抗分子的获得、人工突变和以噬菌体为基础的高通量筛选。这方面的情况，文献11～20有详细描述。

超大规模全人源单抗库

单抗库技术是由Huse WD和J McCafferty等人在1990年前后创立的一项具有革命性意义的技术。此后，科学家们利用该技术进行了大量工作，构建了多种结构的单抗库或其它文库(1～10)。但是由于这种技术本身的局限性(主要是难以获得亲和力能达到治疗性单抗要求的候选分子)，在治疗性单抗开发方面至今只有Humira一个产品获得成功。为了解决这些问题，科学家做了各种努力，但至今未见突破性进展。

克服这种局限性的途径之一是构建超大规模单抗库(1，2，5，8，10)，以获得更加丰富的变异，从而提高获得高技术指标候选单抗的可能性。但由于构建超大规模单抗库实际操作上的难度很大，直到目前仍未获得显著成效，难以从任何规模的单抗库中直接获得技术指标达到治疗性单抗要求的候选分子。

分子进化技术