[发明专利]双液相萃取的生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物转化法生产天然γ-癸内酯的方法，属于生物技术领域。即采用双液相萃取的原位(in site)产物分离技术，生物转化天然原料---蓖麻油制备天然手性γ-癸内酯的方法。

技术背景

γ-癸内酯(gamma decalactone)，又名丙位癸内酯，是一种含有五元内酯环的十碳化合物。内酯可以看作是羟基酸分子内脱去一分子水的产物，由于生成酯的羟基和羧基处于同一分子内，故称为内酯，见下列反应式。

当n＝1时，称为乙位内酯，亦称β-内酯；当n＝2时，称为丙位内酯，亦称γ-内酯；当n＝3时，称为丁位内酯，亦称δ-内酯；当n＞12时，称为大环内酯，这类内酯具有麝香香气。

γ-癸内酯具有水果味、桃子味和典型的椰子香气，香气较桃醛轻飘，并以诱人的桃香和低香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应用，主要用于配制奶油、桃子、柑橘和椰子等类型的香精。1969年，γ-癸内酯被美国食品药品管理局(FDA)认定是安全的食品添加剂和药物添加剂，FDA编号为172.515；我国食品添加剂国标GB2760规定为允许使用的食品香料；FEMA编号为2360。

γ-癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，具有强烈的果香香气，稀释时有桃子香气，在成熟的果实中，含量可达到15ppb，其中89％的是(R)-异构体，11％的是(S)-异构体。大量研究发现，右旋R型γ-癸内酯和左旋S-型γ-癸内酯的香气特征存在明显差异：左旋S-型γ-癸内酯的香气为柔和的、甜甜的椰奶味，有明显酯味特征；右旋R型γ-癸内酯为强烈的、脂甜的水果味，类似椰子，焦糖味。光学纯的γ-癸内酯味道偏甜，清新，有明显的水果甜味，不同对映体间的香气强度不一样，右旋体的香气较浓。由于手性内酯的香气特点，在配制高级食用香精时，选取特定构型的内酯可以得到高仿真的不同来源的香料，所以，手性γ-癸内酯的生产在香精香料行业中越来越受到重视。

γ-癸内酯的制备可以通过天然提取、化学合成、生物技术3种方法来实现。化学合成的内酯主要为无旋光的外消旋体；天然提取虽然可以得到某一光学异构体占优势的产品，但技术复杂、成本高，因而价格昂贵。生物技术方法可以使用廉价的原料生产具有光学活性(手性)的γ-癸内酯，转化条件相对温和、副产物少、环境污染小，因此越来越成为制药业、香料界关注的焦点。

利用生物技术生产γ-癸内酯普遍采用生物转化的方法，所利用的底物主要有羟基脂肪酸、脂肪酸酯和非羟基脂肪酸。生产菌种主要采用酵母菌，一般选用耶氏酵母(Yarrowia sp.)，假丝酵母(Candida sp.)，锁掷孢酵母(Sporidiobolus sp.)等菌株。比如，蓖麻油中的主要组分蓖麻油酸(12-羟基-9-十八碳烯酸，含量在80％以上)在酵母菌的作用下，经过多步β-氧化使碳链缩短，生成γ-癸内酯的直接前体4-羟基癸酸，再环化生成γ-癸内酯(见上述反应方程式，n＝2，R＝-C₆H₁₃)。

由于产物γ-癸内酯对酵母细胞有一定的毒性，当转化体系中γ-癸内酯达到一定浓度后就会抑制酵母的活性，从而限制了γ-癸内酯产生的浓度；另外，在γ-癸内酯生成后会继续β-氧化后降解，导致γ-癸内酯的得率比较低。虽然有文献报道，通过各种方法来提高γ-癸内酯的产量，但截至目前为止，还没有一个经济可行的生产工艺，这使生物技术制备天然γ-癸内酯仍未得到工业化应用。

发明内容

本发明针对生物法生产γ-癸内酯产量低等问题，提供一种采用双液相体系的原位产物分离生物法制备天然手性γ-癸内酯的方法。该方法不仅可以降低产物对菌体的影响，从而提高产量；而且在转化过程中产物全部由溶剂从水相萃取进入有机相中，实现产物的有效原位分离，方便产物的提取，简化了提取工艺。所使用的溶剂经过蒸馏后，可重复利用，从而降低生产成本。

为达到发明目的，本发明采用以下技术方案：

使用解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica As2.1405经过扩大培养的种子液，接种于转化培养基，以蓖麻油为底物，在转速100～200转/分钟、温度20～40℃条件下，生物转化18～72小时生产天然γ-癸内酯。在转化过程中采用添加有机溶剂的原位产物分离技术，减小产物毒性、提高γ-癸内酯产量。

其中所用转化培养基为：蓖麻油10～60克/升，蛋白胨5～20克/升，酵母粉5～20克/升，钾盐1～10克/升，钠盐5～20克/升，乳化剂吐温-800～10克/升，pH 5～9。