[发明专利]抗Cyr61蛋白的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，该抗体能与Cyr61蛋白结合，具有抑制类风关滑膜细胞和恶性肿瘤细胞增殖、粘附和迁延的作用，还可用于Cyr61蛋白的体外检测。

背景技术

人Cyr61蛋白(hCyr61)由381个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸和脯氨酸残基，相对分子质量为42kDa。目前已知，Cyr61广泛表达于多种正常组织细胞，包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、膀胱及血管平滑肌细胞、间质细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等。此外，Cyr61还在某些肿瘤细胞中高表达，目前已知的有乳腺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、黑色素瘤细胞等，是重要的细胞基质调节因子，广泛参与调控细胞增殖、粘附、迁移、分化、凋亡等多种功能。

由于Cyr61蛋白富含半胱氨酸，在表达时容易形成二硫健而导致出现多种构象，而且，Cyr61作为重要的基质蛋白，保守性很强，在哺乳动物之间的同源性很高，尤其是与小鼠的Cyr61同源性高达93％，因此，制备单抗的技术难度较高。由于种种原因，到目前为止，世界上只有商业化的抗Cyr61的多克隆抗体(Santa Crus，USA)，而没有单克隆抗体。

本实验室曾经制备了2株抗Cyr61单抗，分别为杂交瘤CGMCC NO.2766和CGMCCNO.2767(已经申请专利)。为了深入研究Cyr61的功能及进行后续的临床应用，本发明报道了新制备和筛选出的单抗4株：这4株单抗均为IgG1κ型、分别结合不同的Cyr61蛋白的不同区片断、生物学功能也不同。因此，本发明中的4株单抗可用于下列研发应用：如制备人源化抗体、构建用于检测人样本中Cry61表达量的试剂盒等，有巨大的潜在商业价值。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，该抗体能与Cyr61蛋白结合。

本发明的另一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体在抑制细胞增殖、粘附和迁延中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体在Cyr61蛋白体外检测中应用。

本发明所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其能与Cyr61蛋白C端103-381序列(SEQ ID No 1)专一性结合。

根据引物设计原则及GeneBank(NM_001554)中公布的人Cyr61全长cDNA序列2295bp，利用引物设计软件Primer5.0进行设计，去除信号肽部分，两端各加相应的限制性酶切位点构建人Cyr61蛋白(hCyr61(26-381))(SEQ ID No 2)表达载体和人Cyr61蛋白C端103-381(hCyr61(103-381))表达载体并于工程菌中表达。

杂交瘤技术为本领域技术人员制备单克隆抗体所熟知，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，使得融合细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。该技术一般包括三个步骤：(一)细胞融合和筛选；(二)培养基培养和筛选，以及(三)细胞克隆和培养。

本发明使用常用的杂交瘤技术制备抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，包括按照常规免疫方法(如：腹腔、皮下和静脉)，在皮内注射蛋白抗原(如：人Cyr61蛋白)免疫哺乳动物，将免疫动物的脾细胞与同种系来源的骨髓瘤细胞融合。本发明中，纯化的重组人Cyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠(常规方法)。于免疫结束后取小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP20/Ag-14在聚乙二醇(PEG)作用下进行融合，通过ELISA筛选稳定分泌抗hCyr61的单克隆杂交瘤细胞株，ELISA方法鉴定单克隆抗体的亚类和亚型，并比较阳性克隆培养上清抗体的效价。利用纯化的人Cyr61N端融合蛋白片段(hCyr61(103-381))包被固相，通过ELISA方法初步分析筛选出单克隆抗体的结合表位所在区域。选择重链亚型为IgG1的杂交瘤细胞株，通过无血清培养及亲和层析获取少量纯化抗体，从中再选择效价较高的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，制备大量高效价的单克隆抗体，用Protein A-Sepharose柱纯化腹水单克隆抗体并定量。最后，通过Western Blotting进一步明确纯化单克隆抗体的特异性及其抗原结合表位分布区域。

本发明选择杂交瘤细胞株CGMCC 3299和CGMCC 3300制备抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，所制得的抗体为IgG1亚型κ亚类。这些抗体具有抑制抑制人乳腺癌细胞粘附。