[发明专利]一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种克隆水稻基因的方法，具体地说，涉及一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法。

背景技术

随着越来越多的植物基因组测序的完成，从大量的基因组数据中克隆和挖掘相关功能基因成为了人们当前的重要工作。农作物农艺性状大部分为复杂性状，如产量、稻米品质、千粒重、花期、穗长、株高和抗旱性等，都由多个基因共同作用来控制，且每一个基因的贡献都比较小。针对这部分性状的研究，目前多半采用全基因组数量性状位点作图方法来寻找基因组中对该性状有贡献的位点，但要进一步走到克隆相关基因，却还要面临难以逾越的障碍，包括精细定位、数量性状的鉴定和单个基因无法表现等。

在自然界长期进化中，每一种植物都拥有丰富的生态表现型，从这些生态型中挖掘有利基因成为当前分子生物学的重要内容。目前人们已经开发了许多分子生物技术手段，利用它们产生的标记来表现物种的多态性。例如简单重复序列(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、插入缺失标记(InDel)和单核苷酸多态性(SNP)等，但这些技术手段仍难以具体到控制植物发育的基因上。

基因组测序技术的发展促使多个植物的基因组测序工作的完成，针对基因组序列已经知晓的情况下，人们开发了一些加快基因组功能研究的新技术。定向诱导基因组局部突变(TILLING)方法可以直接用来发现化学诱导突变造成的基因变异(HenikoffS，Till BJ，Comai L.TILLING.Traditional mutagenesis meets functional genomics.Plant Physiology.2004，135(2)：630-636.)，也被用来了解自然群体中个体的多态性，被称为ECO-TILLING。

但从当前的研究报告来看，其多态性仅仅是用来进一步测序验证的基础，然后利用序列分析该位点的多态性，是单核苷酸多态性技术的一种延伸。到目前为止，唯一利用该技术在葫芦植物中寻找到一个简单遗传的抗病基因(Nieto C，Piron F，Dalmais M，Marco CF，Moriones E，Gómez-Guillamón ML，Truniger V，Gómez P，Garcia-Mas J，Aranda MA，Bendahmane A.EcoTILLING for the identification of allelic variants ofmelon eIF4E，a factor that controls virus susceptibility.BMC Plant Biology.2007.7：34.)，而利用ECO-TILLING技术克隆复杂性状相关的功能基因是目前需要克服的关键技术难题。

另外，人们也发展了一些分析方法试图解释复杂性状，从而将生物学标记与形态性状联系起来。尽管这些技术手段能够从一些方面反映这些标记在自然状态中与某些形态性状相关联，但这些标记目前多是基因组中随机存在的标记，到定位到具体的相关基因还有相当长的距离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、低成本、快速克隆水稻复杂性状相关联基因的方法。

本发明人针对已经完成测序的基因组植物，利用ECO-TILLING分析方法，直接将CEL I酶酶切后的产物在3％琼脂糖凝胶上电泳，其产生的多态性条带转化为遗传学标记，并对自然群体的复杂性状进行连锁不平衡分析，来寻找并克隆与复杂性状相关的基因。

为了实现本发明目的，本发明所述克隆水稻复杂性状相关基因的方法，其采用以基因组序列已公开的水稻自然群体为基础，采集水稻品种间复杂性状数据，以这些材料的DNA为模板在琼脂糖电泳上进行ECO-TILLING方法分析，将产生的多态性条带转化为遗传学标记，然后利用关联分析软件进行连锁不平衡分析，确定与性状相关联的基因并克隆基因。

本发明选择已经完成了基因组测序并已公开的水稻自然群体，能够方便地提取基因组序列。

所述复杂性数据是该植物在自然栽培条件下或人工模拟自然条件下所采集得到的形态性状数据，如产量、品质、千粒重、花期、株高、穗长和抗旱性等，这些数据在个体间呈连续分布。

所述的ECO-TILLING方法是抽提自然群体中个体基因组DNA，根据基因组注释数据下载各基因家族序列，将研究的目标基因家族设计引物进行PCR，然后以一个常规品种材料为对照品种进行PCR产物两两混合，经过变性复性使双链杂交，最后使用芹菜汁中抽提纯化后的CELI酶对错配产生的拱环进行酶切，产生不同大小的片段。

所述的遗传学标记是经过CEL I酶酶切后产生的多态性条带。