[发明专利]雌二醇化学发光定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于雌二醇(E2)定量检测试剂盒及相关制备方法和使用方式。

背景技术

雌二醇(estradiol，E2)是一种A环为苯环的18碳类固醇激素，分子量272.4Da，为人体雌激素(estrogen)的主要组成部分。血中70％雌二醇与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，25％与血浆白蛋白结合，其余为游离型。E2主要由卵巢滤泡、黄体及妊娠时胎盘产生，极少量由睾丸合成或为睾酮的代谢物，并成为男性雌激素的主要来源。雌激素的另一组成成分雌三醇(estriol，E3)，除孕期胎盘可直接分泌外，均为E2在肝脏中降解的代谢产物。雌激素中除了E2和E3外，还包括雌酮(estrone)，但三者以E2的活性最强，雌酮的活性仅为E2的20％，E3活性最低。

雌二醇的合成呈周期性变化，能够促进女性生殖器官的形成及发育，第二性征的出现及维持，并与孕激素协同形成月经周期。此外，还具有广泛的代谢调剂作用。正常妊娠E2轻度升高，胎盘娩出后急剧下降。异常妊娠时，E2大都升高，如双胎或多胎妊娠以及糖尿病孕妇；若E2降低，则可能为妊娠高血压综合征重症、胎儿宫内死亡或葡萄胎等情况，宜结合其它检查予以确定，以便及时处理。此外，引起E2升高的病理性原因还可能为卵巢癌(如卵巢颗粒层细胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪样细胞瘤等)、心脏病(如心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉狭窄)以及其他疾病(系统性红斑狼疮、肝硬化、男性肥胖症等)。病理性E2降低的因素较多，如卵巢发育低下、原发性卵巢衰竭、垂体性闭经或不孕、柯兴氏综合征、阿狄森氏病、恶性肿瘤、较大范围的感染、肾功能不全、脑及垂体的局灶性病变等。由此可见，E2对于临床疾病的诊断具有广泛的意义，是重要的评价指标之一。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。

化学发光标记免疫分析是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物--acridinium ester(AE)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H₂O₂)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。还有以三联吡啶钌(Ru(byp)₃²⁺)标记物为发光底物，用另一反应物三丙胺(TPA)来激发光反应，在电极表面反复进行氧化还原反应从而产生高效稳定连续发光的电化学发光免疫分析。这些免疫分析方法都需要高精度复杂的自动测量仪器，目前在国内还难以实现。

化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱，通过加入某些特殊的增强剂可增强发光的信号并可大大延长发光的持续时间。

化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度(检测限度可达10^-15～10^-18mol/L)，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂。试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。但是，国外的自动化学发光酶免疫分析仪及与之相匹配的试剂盒多采用封闭体系配合使用，价格昂贵，操作复杂，在国内不易推广。

发明内容