[发明专利]替比夫定耐药变异检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体替比夫定耐药变异遗传的试剂盒，通过检测替比夫定用药靶向位点基因多态性来评估个体替比夫定耐药性。

背景技术

替比夫定，其化学名为：1-((2S，4R，5S)-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-y1)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮；为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L-对映体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗乙肝病毒HBV药物，对HBV复制有强大的抑制作用，优于拉米夫定，且耐药基因突变率低于拉米夫定。对人类DNA聚合酶无影响，对哺乳动物无细胞毒反应，故耐受良好。

替比夫定为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L-对映体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗乙肝病毒DNA聚合酶药物。替比夫定在细胞激酶的作用下被磷酸化为有活性的代谢产物——腺苷，腺苷的细胞内半衰期为14小时。替比夫定5’-腺苷通过与乙肝病毒中自然底物胸腺嘧啶5’-腺苷竞争，从而抑制乙肝病毒DNA聚合酶的活性；通过整和到乙肝病毒DNA中造成乙肝病毒DNA链延长终止，从而抑制乙肝病毒的复制。

核苷类抗乙肝病毒药物具有交叉耐药的特点。发生rtM204I变异或者rtL180M/rtM204V双变异的对拉米夫定耐药的乙肝病毒对替比夫定抗病毒应答率(效果)降低超过1000倍。替比夫定对与rtM204V变异有关的拉米夫定耐药的病毒仍有效(效果降低1.2倍)，表现出中度的抗病毒活性。在细胞培养中，与阿德福韦酯耐药有关的rtA181V变异的病毒对替比夫定的敏感度减低3到5倍；与阿德福韦酯耐药有关的N236T变异的病毒对替比夫定仍然敏感。

替比夫定与拉米夫定同属于L-核苷(酸)类似物，因此与拉米夫定具有几乎相同的耐药性位点，即YMDD位点突变为YIDD。

发明内容

本发明提供一种检测个体替比夫定耐药变异遗传靶向位点基因多态性的试剂盒。

该试剂盒包括：检测YMDD基因rtM204位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，反应缓冲液，去离子水。

本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例  检测试剂盒的使用

步骤1：DNA模板的抽取

用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。

步骤2：荧光定量PCR反应

使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mMMgCl₂溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。

在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。

步骤4：基因型分析

根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。

熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。