[发明专利]按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyI1基因及其表达

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，具体涉及一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyI1(Codon bias optimized xyI1)基因及其表达。

背景技术

木聚糖是半纤维素的重要组成部分，广泛存在于植物细胞壁中，是一种重要的可再生资源。由于木聚糖结构复杂，要彻底降解木聚糖需要多种酶的共同参与和协同。降解时起主要作用的酶为2类：(1)木聚糖酶(endo-1，4-β-Xylanases，EC 3.2.1.8)可以特异的切断β-1，4木糖苷键，使木聚糖降解为低聚木糖和木糖，是木聚糖降解过程中最关键的酶。(2)β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)，作用于寡聚木糖的还原端，并释放出木糖，属外切酶。

木聚糖酶具有重要的潜在应用价值，自20世纪80年代以来，木聚糖酶的应用领域不断扩大。目前，木聚糖酶已成功应用于制浆造纸、食品、饲料、医药等工业中。(1)植物纤维是造纸的主要原料，在造纸工业中，利用木聚糖酶进行纸浆漂白，可以减少氯的用量，降低环境污染；(2)木聚糖酶的分解产物低聚木糖是一种功能性低聚糖，具有良好的酸碱稳定性和耐热性，适用于不同食品中，其甜度仅为蔗糖的40％，食用后不会导致血浆中葡萄糖含量大幅度上升，因而可以作为糖尿病或肥胖症患者的甜味剂；(3)饲料中添加木聚糖酶可以把聚合度较高的木聚糖降解为聚合度较低的小分子片段，破坏细胞壁的结构，将细胞壁束缚的营养物质释放出来，和动物消化道内的消化酶充分接触，从而提高各种养分的消化率。(4)随着现代化工业的快速发展，能源短缺问题日益严重，寻找新的能源已迫在眉睫。植物纤维的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，其中半纤维素约占植物干质量的35％，是自然界中仅次于纤维素含量的第二丰富可再生资源。木聚糖酶可与其它酶协同将植物纤维降解为戊糖和己糖，然后将戊糖和己糖作为发酵底物，进一步通过微生物作用生产乙醇，作为工业生产直接利用的能源，将产生巨大的经济效益，并且可减少对环境的污染，促进自然界碳素循环。

目前木聚糖酶的生产主要依靠真菌、细菌等微生物的发酵。毕赤酵母(Pichia pastoris)系统是近年来发展很快的一个真核表达系统，许多有活性的蛋白质已经在毕赤酵母系统中大量表达。毕赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时，能以甲醇为唯一碳源生长。毕赤酵母表达系统是真核表达系统，可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰，还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌；表达产量高、背景蛋白质少、易于表达产物纯化等优点，是生产木聚糖酶的较为理想的表达系统。而且，偏爱密码子的使用能够较大幅度提高基因的表达水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxynI1基因及其表达，以使所述基因在毕赤酵母中表达出高比活的木聚糖酶。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxynI1基因，采用连续延伸PCR方法合成，其核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。

所述优化的木聚糖酶cxynI1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。

本发明按照毕赤酵母偏爱密码子对原始的xyI1进行改造，改造后的基因序列与原序列(GenBank Accession No.X98518)同源性为76％(参见图1)，其编码的蛋白质含162个氨基酸。

本发明的优化的木聚糖酶cxynI 1基因合成采用连续延伸PCR方法制备而成【熊爱生等，A simple，rapid，high fidelity and cost-effective PCR-basedtwo-step DNA synthesis(PTDS)method for long gene sequences，核酸研究，2004，32：e98】。使用的引物如下：

P1：TCTGTCTCCATGAACCTGGCTTCTGGTGGTTCCTACGGTACTTCCTGGACCAACTGTGGCAACTTCGTTGCTGGTAAGG

P2：TGAAGGAACCAGAGTAGTTGACAGTTCTTCTAGCACCGTTAGCCCAACCCTTACCAGCAACGAAGTTGC

P3：TCAACTACTCTGGTTCCTTCAATCCTTCTGGTAACGCTTACCTGACTTTGTACGGTTGGACTGCTAACCC