[发明专利]一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达

说明书

技术领域

本发明属基因生物工程领域，具体涉及一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及 其表达。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)主要存在于多细胞动物的神经 元间、神经元与肌肉细胞间的化学突触上，是生物神经传导中的一种关键酶， 是主要的信号传递分子。乙酰胆碱酯酶AChE行使水解神经递质乙酰胆碱Ach 的功能，从而终止Ach对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。

研究表明，多种化合物可抑制AChE的活性，导致有机体类胆碱代谢途径 过度，胆碱酯不能被有效水解，大量积累于神经末梢，有机体表现出肌肉抽搐， 中枢神经系统功能紊乱等症状，严重者甚至死亡。在众多抑制剂中，有机磷和 氨基甲酸酯类农药被认为是AChE的专性抑制剂，他们可使昆虫神经系统中的 AChE的丝氨酸羟基基团发生磷酸化或甲氨酰化，使AChE失去活性，不能迅速 水解乙酰胆碱，致使昆虫死亡。

我国是蔬菜生产大国，目前我国蔬菜农业上滥用高毒、高残留农药的现象 屡禁不止。有的不按规范要求使用农药，有的甚至严重违反农药安全使用标准 而使用高毒农药，致使相当部分农产品农药残留明显超标，食用后在人体内积 累，引发疾病，有时甚至发生急性中毒，严重危及人们健康和生命安全。与此 同时，农药残留问题也给农产品生产和正常贸易带来了许多负面影响。近年来， 我国农产品因农药残留超标而被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和中止合同的 事件时有发生。如2002年上海出口到韩国的紫菘因农药残留超标问题而遭到退 货，造成直接经济损失达500多万元。一些国家更是利用国际贸易技术壁垒， 人为地对我国农产品出口设置障碍，使我国蔬菜出口屡屡受阻。如何快速、灵 敏、准确地检测出农产品及其加工产品中的残留农药，是解决上述问题的关键。

目前农药残留检测主要有两大类方法：色谱检测法和快速检测法。色谱检 测法因为其监测数据的精确性和准确性可为农药残留执法提供有力的参考依 据。但其操作程序复杂、需要高技术专业检测人员，检测仪器和费用都相当昂 贵，不利于大众化。快速检测法操作简便、不需要昂贵仪器，适合于现场检测 及大批样品的筛选检测，主要用来防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超 标的蔬菜和水果流入市场。快速检测法中应用最为广泛的是酶抑制法，酶抑制 法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留是根据有机磷农药的毒理特性 对酶分解底物的抑制作用而建立起来的，其中使用较多的是乙酰胆碱酯酶(简 称AChE)。

近年来，我国在利用乙酰胆碱酯酶进行农药残留检测方面的研究取得了一 定的成果，并研发出了相应的试剂盒、速测卡和速测仪。无论采用何种方法， 酶是决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子。目前采用的酶原料主要有两 类：一是从国外进口乙酰胆碱酯酶纯酶制剂，如电鳗和牛血清来源的酶，但价 格较高，而且对有机磷及氨基甲酸酯类农药缺乏敏感性；二是直接从昆虫体内 提取粗酶液，但该类酶产品的纯度及稳定性较差，影响了检测结果的重复性。 国际上先进的农药残留速测技术是利用基因工程技术获得高热稳定性胆碱酯 酶，并制备速测试纸条，克服了胆碱酯酶易失活、不稳定等缺点，使检测效率 大幅度提高。

自上世纪90年代起，多种来源(包括线虫、果蝇、电鳗、鼠类、人等)的 乙酰胆碱酯酶基因在昆虫细胞、爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞甚至植物株系中 成功获得了表达【Morel and Massoulié，1997；Simon and Massoulié，1997； Mendelson et al，1998；Hussein et al，1999，2000；Mor et al，2001；Uccelletti et al，2002；Ovadia Lazari et al，2003】。研究者利用这些重组蛋白注射老鼠、豚鼠 和灵长类，证明在有机磷中毒时间中取得了良好的预防与治疗效果。不同生物 来源的AChE对抑制剂的敏感程度不同。蝇类的AChE发生磷酸化与甲氨酰化 的速度高于其它生物的酶，也就是说，此类酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药是 最为敏感的。因此，是农药残留检测的理想生物学材料。