[发明专利]一种P型ATP酶基因突变的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种P型ATP酶基因突变的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

P型ATP酶(ATP7Base，ATP7B)基因定位于13q14.3，全长约80kb，含有21个外显子和20个内含子，其cDNA编码一种由1411个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶。该酶主要分布在肝、肾和胎盘，而少见于心、脑、肺和肌肉等组织，其主要生物学功能是在高尔基体内接受铜伴侣蛋白传递的铜，合成铜蓝蛋白，另外可以在高铜环境下重新定位，携带所结合的铜促使其从胆汁中排出。

目前，国内外已发现ATP7B基因突变200余种，这些突变位点几乎分布于ATP7B基因的各个外显子，甚至有的还分布在内含子或剪接区内，突变类型包括错义突变、无义突变、缺失和插入等，ATP7B的突变方式多种多样，但主要以点突变为主，且多累及ATP酶功能区，而不是金属离子结合区。并且在不同地域人群中所发现的热点突变区明显不同。1995年Thomas等报道了3例中国香港人ATP7B患者，他们的ATP7B基因上都存在R778L(exon8)纯合突变，这是有关中国人该病基因外显子突变类型的首次报道。1996年台湾学者Chuang等报道在台湾ATP7B患者中检测到了该位点的两种突变：R778L和R778Q，突变率分别为11.4％和9.1％。上海刘晓青等报道R778L突变频率为47.2％，未发现R778Q突变。Ye等对中国东部50例ATP7B患者研究后指出，R778L突变频率高达60％。进一步研究表明，我国ATP7B与白种人的外显子突变特点有明显差异，第8号外显子R778L突变是中国人群的高频突变点，其突变频率为11.4％～60％。Park等检测了120例韩国ATP7B患者，R778L突变频率达39.2％，同时日本研究结果也表明R778L是高频突变点。8号外显子位于ATP7B蛋白的跨膜功能区，该位点的突变可引起蛋白的1级和2级结构改变，导致铜转运在细胞膜上停滞。12号外显子的T935M突变也是我国肝豆状核变性基因突变热点，在吴志英等对44例肝豆状核变性患者的研究中指出，18.1％的患者在12号外显子上检测到突变，其中T935M突变占6.8％，G943D占2.3％，此2种突变国外均未见报道。

现有检测ATP7B基因突变的方法主要是限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和单链构象多态性(PCR-SSCP)。PCR-RFLP是利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的片断将产生不同的电泳图谱，但这种方法只能用于检测单一位点，且这个位点必须恰好是可以酶切的，存在一定局限性。PCR-SSCP是根据单链DNA分子在中性聚丙酰胺凝胶中电泳时由于不同的立体构象造成不同的泳动速率，产生不同的条带来判断突变的存在，但此法只能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行、检出率与可重复性高的P型ATP酶基因突变的检测方法。

为了实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种P型ATP酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1.采集被测者口腔粘膜样本：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

步骤2.基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提被测者口腔粘膜上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

步骤3.基因分型：

将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，2个反应孔分别检测ATP7B基因8号以及12号外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点确定基因型：

步骤3-1，反应体系配置：

在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；

ATP7B基因第8外显子正向和反向引物如下：

正向引物：ctcttggtcatccattcctg

反向引物：catggtgttcagaggaagtgag

ATP7B基因第12外显子正向和反向引物如下：

正向引物：actggtggaagaggctcaga

反向引物：cctgcagaaggagagtgactg

步骤3-2，PCR反应条件：