[发明专利]一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，用于检测CCND1和STK15 基因的变异，属于分子生物学技术领域。

背景技术

大样本量中国人群研究证实，细胞周期素CCND1和丝氨酸/苏氨酸激酶STK15基因的 变异在中国人群众普遍存在。以往的检测方法在对CCND1和STK15基因进行检测时出现的 假阳性现象无法很好的排查和解释。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确率高的细胞周期调节相关基因的基因型检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种细胞周期调节相关基因的基因型检 测方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1.检测的样品类型与采样方法：

用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；

步骤2.基因组DNA的抽提方法：

采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一 2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；

步骤3，荧光定量PCR反应：

将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素(CCND1) rs9344和丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增设2个不含DNA模版的NTC空 白对照孔；

在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10μl，即2μl浓度为 20ng/μl的DNA模板、1μl10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度为25mM的合成DNA 的四种脱氧核苷酸底物d NTP、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl 的Taq DNA聚合酶、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物、0.225μl浓度为 20μM的反向引物、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光 探针，其中，2个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光A型探针以及带FAM荧光G型 探针如下：

细胞周期素(CCND1)SEQ ID NO1：Rs9344：

带VIC荧光A型探针：ACCCaGTAAGTGA

带FAM荧光G型探针：ACCCgGTAAGTGA

正向引物：TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC

反向引物：TTGGCACCAGCCTCGGCATT

丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)SEQ ID NO2：Rs2273535：

带VIC荧光A型探针：AAaTTGCTGAGT

带FAM荧光T型探针：AAtTTGCTGAGT

正向引物：AGAATTTGAAGGACACAAGA

反向引物：TGCCAGAAAGTTTATTTTCT

将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、 10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧 光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素(CCND1)rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15 (STK15)s2273535两张图；

步骤4：SNP基因型分析：

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个图和一个NTC空白对照进行比较， 每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧 光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

(1)、细胞周期素(CCND1)rs9344

在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、 坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；

(2)、丝氨酸/苏氨酸激酶15(STK15)rs2273535

在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、 坐标轴右上区域点为AT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型(该基因型在中国人群中 频率很低)。