[发明专利]核酸的碱基序列的识别方法

权利要求书

1.识别核酸的碱基序列的差异的方法，其是利用在实质上等温下进行的核酸扩增法来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异的方法，其特征在于，

使用(1)与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸，和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交、而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸，将(1)中的寡核苷酸称为引物，将(2)中的寡核酸称为屏蔽寡核酸，该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与引物的包括3’末端的区域杂交。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与屏蔽寡核酸的包括5’末端的区域杂交。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，

引物相对第一核酸比相对第二核酸更互补。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，

引物被设计成只在3’末端的连续的区域与第一核酸或第二核酸杂交。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，

第一核酸与第二核酸存在单碱基多态的关系。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，

使用至少两种引物，该至少两种引物被设计成彼此与DNA两条链的不同链互补，而且在与DNA链上的自身相同的序列的3’末端侧存在的区域，另一方寡核苷酸引物成为互补。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

培养含有至少1种脱氧核苷酸3磷酸、具有至少1种链置换能的DNA聚合酶及成为模板的核酸片断的反应溶液，进行以上述引物的3’末端为起点的聚合酶反应，从而扩增该核酸片断，由此识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，

利用扩增速度的差来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，

反应溶液进一步含有至少0.01％以上的表面活性剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，

反应溶液进一步含有至少0.05％以上的表面活性剂。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，

表面活性剂为非离子性表面活性剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，

非离子性表面活性剂的HLB值为12以上。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，

非离子性表面活性剂的HLB值为14以上。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，

非离子性表面活性剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系、聚氧化乙烯烷基醚系。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，

聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非离子性表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐一脂肪酸酯。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，

由以下化学式表示：

式中，x+y+z+w＝20，R：表示碳原子数12～18的烷基。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非离子性表面活性剂选自聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯的至少1种。

19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，

反应溶液还含有2价的阳离子。

20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，

反应溶液还含有熔解温度调节剂。