[发明专利]一对扩增嗜酸硫杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测嗜酸硫杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一对扩增嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测嗜酸硫杆菌的方法

背景技术

生物冶金技术是利用微生物、空气和水等天然物质从矿石中直接提取有价金属，而无需选矿及火法炼制的短流程清洁生产工艺，通过微生物氧化矿石产生硫酸高铁和硫酸等浸出剂，浸出过程基本不消耗除矿石、水、空气以外的其它资源，没有二氧化硫排放，资源消耗低，对环境友好。生物冶金新技术使浮选-火法冶炼工艺不能利用的低品位及偏远地区铜资源得以大规模开发，并使过去长年堆存的表外矿即使含铜0.1％以下亦有经济利用价值。生物冶金技术被认为是二十一世纪矿产资源加工的战略性技术。

生物冶金过程是一个化学过程，微生物的作用主要是氧化铁和还原态硫，以及提供溶解反应发生的空间(胞外聚合层)，但是细菌的作用是不能忽视的。浸矿环境中的细菌可以分为两种：一种就是可以氧化铁或(和)硫的细菌，如At.ferrooxidans，氧化Fe²⁺的速度是溶解氧氧化速度的5×10⁵～1×10⁶倍，产生的Fe³⁺通过化学作用氧化硫化矿，氧化硫产生的硫酸也可溶解一部分硫化矿；还有一种菌就是异养菌，它们通过代谢自养菌产生的有机物获得能量，一方面可以消除有机物对自养菌的毒害作用，另一方面可以在低氧压条件下异养生长，以Fe³⁺为电子受体，可以产生Fe²⁺供铁氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。

生物浸矿过程是一个复杂的过程，其中涉及多种因素(生物、化学、物理)的相互作用，微生物群落会随着浸矿环境中温度、pH、溶解氧浓度、CO₂浓度、Fe³⁺/Fe²⁺、硫酸盐浓度和金属离子浓度等的变化而变化，而微生物群落的变化就会影响到浸矿的效率。现有的浸矿微生物检测的方法多是基于PCR扩增后，再对所扩增的PCR产物进行检测，这种终点法的检测往往不能真实的反应浸矿环境中的微生物组成。在PCR基础上发展起来的real-time PCR技术，实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大缩短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。

因此，real-time PCR技术的应用能够解决快速定量检测浸矿微生物的要求。

发明内容

本发明提供一对扩增嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测嗜酸硫杆菌属的方法，该方法实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大缩短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供的用于检测嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)的引物对包括：正向引物(F)(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物(R)(5’-CATTGCTTCGTCAGGGTTG-3’)(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成).

这种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测嗜酸硫杆菌属方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；

(2)、在实时定量PCR仪中扩增环境中嗜酸硫杆菌属的16S rDNA基因，通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数。

由于细菌在进化过程中基因存在一定的突变，因此在引物设计时在Genbank中选取某种细菌及相似细菌的16S rDNA序列进行比对，挑取该种细菌不同于别的细菌的序列作为设计引物的基础(用Promega 3)。