[发明专利]一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法有效
| 申请号： | 200910204584.3 | 申请日： | 2009-12-01 |
| 公开（公告）号： | CN101705285A | 公开（公告）日： | 2010-05-12 |
| 发明（设计）人： | 刘兴宇;陈勃伟;温建康 | 申请（专利权）人： | 北京有色金属研究总院 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;G01N21/64 |
| 代理公司： | 北京北新智诚知识产权代理有限公司 11100 | 代理人： | 郭佩兰 |
| 地址： | 100088*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一对 扩增 螺旋菌 16 rrna 基因 引物 以及 实时 pcr 定量 检测 方法 | ||
1.一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物，其特征在于：所 述的引物对包括：正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAG TTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物的序列是5’-GTTGCTGCGTCAGGG TTT-3’。
2.一种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测钩端螺旋 菌属的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用 上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的PCR产物为模板用上述 引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓 度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行 梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；
(2)、在实时定量PCR仪中以上述引物扩增环境中钩端螺旋菌属的 16S rDNA基因，通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1) 中已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数；
所用的反应体系组成为12.5μl的含有SYBR Green I染色剂、 AmpliTaqDNA聚合酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBR Green PCR Master Mix，正向引物6.25pmol，反向引物6.25pmol，模板1μl，无菌去离 子水6.5μl；
所用的反应条件为95℃预变性5min，然后为45个循环的95℃变性 15s，60℃延伸1min。
3.根据权利要求2所述实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法， 其特征在于：所述的环境为生物浸出液或酸性矿坑水。
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